ARN SARS-Cov-2 e gjetur në grimcat e Bergamos në Italinë Veriore: Dëshmia e parë paraprake

Sindroma e rëndë akute e frymëmarrjes e njohur si sëmundja COVID-19 – për shkak të virusit SARS-CoV-2 – njihet se përhapet nëpërmjet pikave të frymëmarrjes dhe kontakteve të ngushta.[1]Barra e COVID-19 ishte jashtëzakonisht e rëndë në Lombardi dhe Luginën Po (Italia Veriore),[2] një zonë e karakterizuar nga përqëndrime të larta të grimcave, të cilat tashmë dihet se prodhojnë efekte negative në shëndetin e njeriut.[3]Shifrat rajonale të disponueshme për Italinë në datën 12 prill tregojnë se rreth 30% e njerëzve aktualisht pozitivë jetojnë ende në Lombardi (rreth 40% nëse merren parasysh rastet e përgjithshme të konfirmuara që nga fillimi i epidemisë), e ndjekur nga Emilia Romagna (13.5%) , Piemonte (10,5%) dhe Veneto (10%).[2]Këto katër rajone të Luginës Po përbëjnë 80% të vdekjeve totale të regjistruara në Itali dhe 65% të pranimeve në Njësitë e Kujdesit Intensiv.[2]

Një hulumtim i kryer nga Shkolla e Shëndetit Publik të Harvardit duket se konfirmon një lidhje midis rritjes së përqendrimeve të PM dhe shkallës së vdekshmërisë për shkak të COVID-19 në SHBA[4] Në komunikimet e mëparshme, ne kemi hipotezuar mundësinë që SARS-CoV-2 virusi mund të jetë i pranishëm në grimcat (PM) gjatë përhapjes së infeksionit, [5,6] në përputhje me provat tashmë
në dispozicion për viruse të tjera.[7-15] Megjithatë, çështja e mikrobiomës së lidhur me PM-në ajrore, veçanërisht në mjediset urbane, mbetet kryesisht e nën-hetuar, [16] dhe – aktualisht – askush nuk ka kryer ende studime eksperimentale me synim specifik. në konfirmimin ose përjashtimin e pranisë së SARS-CoV-2 në PM.
Këtu, ne paraqesim rezultatet e para të analizave që kemi kryer në 34 mostra PM10 të PM10 të jashtme/ajrore nga një zonë industriale e Provincës Bergamo, të mbledhura me dy kampionues të ndryshëm ajri gjatë një periudhe të vazhdueshme 3-javore, nga 21 shkurti deri në mars. 13.
Duke ndjekur metodologjinë e përshkruar nga Pan et al.në 2019 (për mbledhjen, madhësinë e grimcave dhe zbulimin e viruseve të ajrit),[17] mostrat PM u mblodhën në filtra me fibra kuarci duke përdorur një kampionues ajri gravimetrik me volum të ulët (38,3 l/min për 23 orë), në përputhje me metodën e referencës EN12341 :2014 për monitorimin e PM10.Grimcat u bllokuan në filtra me 99.9% tipikeMbajtja e aerosolit, e ruajtur siç duhet dhe e dorëzuar në laboratorin e Gjenomikës së Aplikuar dhe Krahasuese të Universitetit të Triestes.Duke pasur parasysh natyrën "mjedisore" të kampionit, me sa duket e pasur me frenues të polimerazave të ADN-së, ne vazhduam me nxjerrjen e ARN-së duke përdorur kompletin e mikrobit fekal të tokës ARN të shpejtë të përshtatur me llojin e filtrave.[18]Gjysma e filtrit u rrotullua, me anën e sipërme të kthyer nga brenda,në një tub polipropileni 5 ml, së bashku me rruazat e dhëna në komplet.Nga 1 ml fillestar i lysisbuffer, ne mundëm të merrnim rreth 400 ul tretësirë, e cila më pas u përpunua siç përcaktohet nga protokollet standarde, duke rezultuar në një eluat përfundimtar prej 15 ul.Më pas, 5 ul u përdorën për testimin SARS-CoV-2.Duke pasur parasysh origjinën e veçantë të kampionit, u përdor qScript XLT 1-Hapi RT-qPCR ToughMix.[19]Sistemet e amplifikimit ishin ato të protokollit të zhvilluar nga Corman et al, të publikuar në faqen e internetit të OBSH-së [20].
Testi kishte për qëllim në mënyrë eksplicite konfirmimin ose përjashtimin e pranisë së SARS-CoV-2 ARN në grimcat.Analiza e parë përdori "gjenin E" si një shënues molekular dhe prodhoi një rezultat pozitiv mbresëlënës në 15 nga 16 filtra edhe nëse, siç mund të prisnim, Ct ishte midis 36-38 cikleve.
Pas kësaj, ne kemi përsëritur analizën në 6 prej filtrave pozitivë (tashmë pozitiv ndaj "gjenit E") duke përdorur "gjenin RtDR" si një shënues molekular - i cili është shumë specifik për SARS-CoV-2 - duke arritur në 5 rezultate domethënëse. e pozitivitetit;testet e kontrollit për të përjashtuar pozitivitetin e rremë u kryen gjithashtu me sukses (Fig. 1).
Për të shmangur mbarimin e materialit të pakët të disponueshëm të kampionimit, ARN-të e mbetura të nxjerra u dorëzuan në Spitalin Universitar lokal (një nga qendrat klinike të autorizuara nga qeveria italiane për testet diagnostikuese SARS-CoV-2), për të kryer një të dytë. test i verbër paralel.Ky laborator i dytë klinik testoi 34 ekstraktime të ARN-së për gjenet E, N dhe RdRP, duke raportuar 7 rezultate pozitive për të paktën një nga tre gjenet shënues, me pozitivitet të konfirmuar veçmas për të tre shënuesit (Fig. 2).Për shkak të natyrës së kampionit dhe duke pasur parasysh se kampionimi nuk është kryer për qëllime diagnostike klinike por për teste të ndotjes së mjedisit (duke marrë parasysh gjithashtu se filtrat janë ruajtur për të paktën katër javë përpara se t'i nënshtroheshin analizave gjenetike molekulare, sipasojë e mbylljes italiane), mund të konfirmojmë se kemi demonstruar në mënyrë të arsyeshme praninë e ARN virale SARS-CoV-2 duke zbuluar "gjenin RtDR" shumë specifik në 8 filtra.Megjithatë, për shkak të mungesës së materialeve shtesë nga filtrat, ne nuk ishim në gjendje të përsërisim një numër të mjaftueshëm testesh për të treguar pozitivitet për të tre shënuesit molekularë njëkohësisht.
Kjo është prova e parë paraprake që ARN-ja e SARS-CoV-2 mund të jetë e pranishme në grimcat e jashtme, duke sugjeruar kështu që, në kushtet e stabilitetit atmosferik dhe përqendrimeve të larta të PM, SARS-CoV-2 mund të krijojë grupime me PM në natyrë dhe - nga zvogëlimi i koeficientit të difuzionit të tyre – rrisin qëndrueshmërinë e virusit në atmosferë.Konfirmime të mëtejshme të kësaj paraprakeprovat janë në vazhdim dhe duhet të përfshijnë vlerësimin në kohë reale për vitalitetin e SARS-CoV-2 si dhe virulencën e tij kur absorbohet në grimcat.Aktualisht, nuk mund të bëhen supozime në lidhje me korrelacionin midis pranisë së virusit në PM dhe përparimit të shpërthimit të COVID-19.Çështje të tjera që duhen adresuar në mënyrë specifike janë përqendrimet mesatare të PM eventualishtkërkohet për një "efekt nxitës" të mundshëm të ngjitjes (në rast se konfirmohet se PM mund të veprojë si një "bartës" për bërthamat e pikave virale), apo edhe mundësinë teorike të imunizimit si pasojë e ekspozimeve të dozës minimale në pragjet më të ulëta të PM .

Fig.1 Kurbat e amplifikimit të gjeneve E (A) dhe RdRP (B): vijat e gjelbra përfaqësojnë filtra të testuar;vija të kryqëzuarapërfaqëson nxjerrjet e filtrit referencë;vijat e kuqe paraqesin amplifikimin e mostrave pozitive.
Fig.1

Fig.2.Rezultatet pozitive (të shënuara me X) për gjenet E, N dhe RdRP të marra për të gjithë kampionin 34 PM10filtra të testuar në analizat e dyta paralele.
Fig.2Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Prisco Milessi8, Michelle 9,
1. Departamenti i Kimisë Industriale, Universiteti i Bolonjës, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bolonja, Itali
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Qendra Ndërdepartamentale për Kërkime Industriale “Burimet e Rinovueshme, Mjedisi, Rritja Blu, Energjia”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Dega e Biologjisë, Universiteti “Aldo Moro” i Barit, Bari, Itali
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Departamenti i Shkencave Kimike dhe Farmaceutike, Universiteti i Triestes, Trieste, Itali
e-mail: barbierp@units.it
5. Divizioni i Kërkimeve Mjedisore, TCR TECORA, Milano, Itali
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Departamenti i Shkencave të Jetës – Universiteti i Triestes, Trieste, Itali
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Divizioni i Mjekësisë Laboratorike, Spitali Universitar Giuliano Isontina (ASU GI), Trieste, Itali
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Shoqëria Italiane e Mjekësisë Mjedisore (SIMA), Milano, Itali
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Departamenti i Shkencave Mjedisore dhe Poicy, Universiteti i Milanos, Milano, Itali
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Autor përkatës:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it

Referencat
1. Organizata Botërore e Shëndetësisë, Mënyrat e transmetimit të virusit që shkakton COVID-19: implikimet për rekomandimet paraprake të IPC, Përmbledhje shkencore;në dispozicion në: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 mars 2020)
2. Ministria Italiane e Shëndetësisë, buletini ditor Shpërthimi i Covid-19 në Itali, i disponueshëm në http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Agjencia Evropiane e Mjedisit, Raporti i Cilësisë së Ajrit në Evropë 2019;Nr 10/2019;Agjencia Evropiane e Mjedisit: Kopenhagë, Danimarkë, e disponueshme në: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Ekspozimi ndaj ndotjes së ajrit dhe vdekshmëria nga COVID-19 në Shtetet e Bashkuara, në dispozicion në: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Shoqëria Italiane e Mjekësisë Mjedisore (SIMA), Letra e Pozicionimit të Grimcave dhe COVID-19,
në dispozicion në: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., A ka një rol të besueshëm për lëndët e grimcave në përhapjen e COVID-19 në Italinë Veriore?, BMJ Rapid Responses, 8 Prill 2020, në dispozicion në: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Gjenerimi i grimcave të imta fekale të kontaminuara nga virusi i influencës së shpendëve (AIV) (PM2.5): Gjenomi dhe zbulimi i infektivitetit dhe llogaritja e impisionit.Mikrobiologji Veterinare.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Transmetimi ajror mund të ketë luajtur një rol në përhapjen e shpërthimeve shumë patogjene të gripit të shpendëve të vitit 2015 në Shtetet e Bashkuara.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Vlerësimi për ndikimin e ngjarjeve të pluhurit në incidencën e fruthit në Kinën perëndimore.Mjedisi Atmosferik.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Një model i integruar për të parashikuar përhapjen atmosferike të Epidemiolit të virusit Afta Epizootike.Infect., 124, 577-590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Drejtime të reja: Transmetimi Ajror i Mjedisit Atmosferik të Virusit të Sëmundjeve Aftës Epidemike, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Normat e depozitimit të viruseve dhe baktereve mbi shtresën kufitare atmosferike.Gazeta ISME.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Anketa gjatësore e mikrobiomës së lidhur me lëndën e grimcave në një megaqytet.Biologjia e Gjenomit.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Transmetimi në ajër mund të ketë
luajti një rol në përhapjen e shpërthimeve të gripit të shpendëve shumë patogjene të vitit 2015 në Shtetet e Bashkuara.Shkencë
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Vlerësimi për ndikimin e ngjarjeve të pluhurit në incidencën e fruthit në Kinën perëndimore.Mjedisi Atmosferik.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, ​​G., Jiang, J., Zhu, TF Ekstraktimi i optimizuar i ADN-së dhe sekuenca metagjenomike e komuniteteve mikrobike në ajër .Nat.Protok.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Mbledhja, madhësia e grimcave dhe zbulimi i viruseve të ajrit.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, përshkrimi i produktit, i disponueshëm në: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, përshkrimi i produktit, i disponueshëm në: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, ​​R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Zbulimi i koronavirusit të ri 2019 (2019-nCoV) me RT-PCR në kohë reale.Eurosurveillance, 25(3), në dispozicion në:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/

Origjinali: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995


Koha e postimit: Prill-18-2020