Uważa się, że ciężki ostry zespół oddechowy znany jako choroba COVID-19 – wywołany wirusem SARS-CoV-2 – rozprzestrzenia się drogą kropelkową i przez bliskie kontakty.[1]Obciążenie COVID-19 było wyjątkowo poważne w Lombardii i dolinie Padu (północne Włochy)[2], na obszarze charakteryzującym się wysokim stężeniem pyłu zawieszonego, o którym już wiadomo, że ma negatywny wpływ na zdrowie ludzi[3].Dane regionalne dostępne dla Włoch na dzień 12 kwietnia pokazują, że około 30% obecnie pozytywnych osób nadal mieszka w Lombardii (około 40%, jeśli wziąć pod uwagę ogólną liczbę przypadków potwierdzonych od początku epidemii), a następnie Emilia-Romania (13,5%) , Piemont (10,5%) i Veneto (10%).[2]Te cztery regiony Doliny Padu odpowiadają za 80% wszystkich zgonów zarejestrowanych we Włoszech i 65% przyjęć na oddziały intensywnej terapii.[2]
Badanie przeprowadzone przez Harvard School of Public Health wydaje się potwierdzać związek między wzrostem stężenia PM a śmiertelnością z powodu COVID-19 w USA[4]. W poprzednich komunikatach postawiliśmy hipotezę, że SARS-CoV-2 wirus może być obecny na cząstkach stałych (PM) podczas rozprzestrzeniania się infekcji, [5,6] zgodnie z dowodami już
dostępne dla innych wirusów.[7-15] Jednak kwestia mikrobiomu związanego z pyłami zawieszonymi w powietrzu, zwłaszcza w środowiskach miejskich, pozostaje w dużej mierze niedostatecznie zbadana[16] i – obecnie – nikt nie przeprowadził badań eksperymentalnych specjalnie ukierunkowanych przy potwierdzeniu lub wykluczeniu obecności SARS-CoV-2 na PM.
Tutaj przedstawiamy pierwsze wyniki analiz, które przeprowadziliśmy na 34 próbkach PM10 z zewnątrz/w powietrzu PM10 z terenu przemysłowego w prowincji Bergamo, pobranych za pomocą dwóch różnych próbników powietrza przez nieprzerwany okres 3 tygodni, od 21 lutego do marca 13.
Zgodnie z metodologią opisaną przez Pan i in.w 2019 r. (w celu zbierania, sortowania cząstek i wykrywania wirusów przenoszonych drogą powietrzną)[17] próbki cząstek stałych pobrano na filtry z włókna kwarcowego przy użyciu grawimetrycznego próbnika powietrza o małej objętości (38,3 l/min przez 23 h), zgodnego z metodą referencyjną EN12341 :2014 dla monitorowania PM10.Cząstki stałe zostały zatrzymane na filtrach z typowym 99,9%.retencja aerozolu, odpowiednio przechowywana i dostarczana do laboratorium Genomiki Stosowanej i Porównawczej Uniwersytetu w Trieście.Biorąc pod uwagę „środowiskowy” charakter próbki, przypuszczalnie bogatej w inhibitory polimeraz DNA, przystąpiliśmy do ekstrakcji RNA przy użyciu zestawu mikroorganizmów kałowych Quick RNA dostosowanych do typu filtrów.[18]Półfiltr zwinięty górną stroną do wewnątrz,w tubie polipropylenowej o pojemności 5 ml wraz z kulkami dołączonymi do zestawu.Z początkowego 1 ml buforu do lizy byliśmy w stanie uzyskać około 400 μl roztworu, który następnie przetwarzano zgodnie ze standardowymi protokołami, uzyskując końcowy eluat o objętości 15 μl.Następnie do badania SARS-CoV-2 użyto 5 ul.Biorąc pod uwagę szczególne pochodzenie próbki, użyto qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Systemy amplifikacji były zgodne z protokołem opracowanym przez Cormana i wsp., opublikowanym na stronie internetowej WHO [20].
Test miał jednoznacznie na celu potwierdzenie lub wykluczenie obecności RNA SARS-CoV-2 na cząstkach stałych.Pierwsza analiza wykorzystała „gen E” jako marker molekularny i dała imponujący pozytywny wynik na 15 z 16 filtrów, nawet jeśli, jak mogliśmy się spodziewać, Ct wynosiło między 36-38 cykli.
Następnie powtórzyliśmy analizę na 6 pozytywnych filtrach (już pozytywnych dla „genu E”), używając „genu RtDR” jako markera molekularnego – który jest wysoce specyficzny dla SARS-CoV-2 – osiągając 5 znaczących wyników pozytywności;pomyślnie przeprowadzono również testy kontrolne w celu wykluczenia wyników fałszywie dodatnich (ryc. 1).
Aby uniknąć wyczerpania skąpego dostępnego materiału do pobierania próbek, pozostałe wyekstrahowane RNA zostały dostarczone do miejscowego Szpitala Uniwersyteckiego (jednego z ośrodków klinicznych autoryzowanych przez rząd włoski do testów diagnostycznych SARS-CoV-2), w celu wykonania drugiego równoległy ślepy test.To drugie laboratorium kliniczne przetestowało 34 ekstrakcje RNA dla genów E, N i RdRP, zgłaszając 7 pozytywnych wyników dla co najmniej jednego z trzech genów markerowych, z pozytywnością potwierdzoną oddzielnie dla wszystkich trzech markerów (ryc. 2).Ze względu na charakter próbki oraz biorąc pod uwagę, że pobieranie próbek nie zostało przeprowadzone do celów diagnostyki klinicznej, lecz do badań zanieczyszczenia środowiska (biorąc również pod uwagę fakt, że filtry były przechowywane przez co najmniej cztery tygodnie przed poddaniem ich analizie molekularno-genetycznej, zgodnie z art.konsekwencją włoskiego zamknięcia), możemy potwierdzić, że w uzasadniony sposób wykazaliśmy obecność RNA wirusa SARS-CoV-2 poprzez wykrycie wysoce specyficznego „genu RtDR” na 8 filtrach.Jednak ze względu na brak dodatkowych materiałów z filtrów nie byliśmy w stanie powtórzyć wystarczającej liczby testów, aby wykazać pozytywność dla wszystkich 3 markerów molekularnych jednocześnie.
Jest to pierwszy wstępny dowód na to, że RNA SARS-CoV-2 może być obecny na pyle zawieszonym na zewnątrz, co sugeruje, że w warunkach stabilności atmosferycznej i wysokich stężeń PM SARS-CoV-2 może tworzyć skupiska z pyłem zawieszonym na zewnątrz i – przez zmniejszając ich współczynnik dyfuzji – zwiększają trwałość wirusa w atmosferze.Dalsze potwierdzenia tego wstępnegodowody są w toku i powinny obejmować ocenę w czasie rzeczywistym żywotności SARS-CoV-2, a także jego zjadliwości po adsorbowaniu na cząstkach stałych.Obecnie nie można poczynić żadnych założeń dotyczących korelacji między obecnością wirusa na PM a progresją epidemii COVID-19.Inne kwestie, którymi należy się zająć, to ostatecznie średnie stężenia PMwymagane dla potencjalnego „efektu wzmocnienia” zarażenia (w przypadku potwierdzenia, że PM może działać jako „nośnik” dla jąder kropelek wirusa), a nawet teoretycznej możliwości uodpornienia w wyniku narażenia na minimalną dawkę przy niższych progach PM .
Ryc.1 Krzywe amplifikacji genów E (A) i RdRP (B): zielone linie reprezentują testowane filtry;linie krzyżowereprezentuje referencyjne ekstrakcje filtrów;czerwone linie reprezentują amplifikację próbek dodatnich.
Ryc.2.Wyniki pozytywne (oznaczone X) dla genów E, N i RdRP uzyskane dla całej próbki 34 PM10filtry testowane w drugiej analizie równoległej.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, Alessandro Miani8,9
1. Katedra Chemii Przemysłowej, Uniwersytet Boloński, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bolonia, Włochy
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Międzywydziałowy Ośrodek Badań Przemysłowych „Źródła Odnawialne, Środowisko, Niebieski Wzrost, Energia”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Wydział Biologii Uniwersytetu „Aldo Moro” w Bari, Bari, Włochy
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Wydział Nauk Chemicznych i Farmaceutycznych Uniwersytetu w Trieście, Triest, Włochy
e-mail: barbierp@units.it
5. Oddział Badań Środowiskowych, TCR TECORA, Mediolan, Włochy
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Wydział Nauk Przyrodniczych – Uniwersytet w Trieście, Triest, Włochy
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Oddział Medycyny Laboratoryjnej Szpitala Uniwersyteckiego Giuliano Isontina (ASU GI), Triest, Włochy
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Włoskie Towarzystwo Medycyny Środowiskowej (SIMA), Mediolan, Włochy
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Wydział Nauk o Środowisku i Polityce, Uniwersytet w Mediolanie, Mediolan, Włochy
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Autor korespondujący:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Bibliografia
1. Światowa Organizacja Zdrowia, Sposoby przenoszenia wirusa powodującego COVID-19: implikacje dla zaleceń IPC dotyczących środków ostrożności, Informacje naukowe;dostępne pod adresem: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 marca 2020 r.)
2. Włoskie Ministerstwo Zdrowia, codzienny biuletyn Epidemia Covid-19 we Włoszech, dostępny pod adresem http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Europejska Agencja Środowiska, Raport o jakości powietrza w Europie 2019;nr 10/2019;Europejska Agencja Środowiska: Kopenhaga, Dania, dostępna pod adresem: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Exposure to air zanieczyszczenie i COVID-19 śmiertelność w Stanach Zjednoczonych, dostępne pod adresem: https://projects.iq.harvard.edu/ pliki/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Włoskie Towarzystwo Medycyny Środowiskowej (SIMA), Stanowisko w sprawie cząstek stałych i COVID-19,
dostępne pod adresem: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Czy istnieje wiarygodna rola dla cząstek stałych w rozprzestrzenianiu się COVID-19 w północnych Włoszech?, BMJ Rapid Responses, 8 kwietnia 2020 r., dostępne pod adresem: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generowanie wirusa ptasiej grypy (AIV) zanieczyszczonego drobnym pyłem zawieszonym w kale (PM2,5): wykrywanie genomu i infekcyjności oraz obliczanie imisji.Mikrobiologia Weterynaryjna.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Przenoszenie drogą powietrzną mogło odegrać rolę w rozprzestrzenianiu się ognisk wysoce zjadliwej ptasiej grypy w 2015 r. Stany Zjednoczone.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Ocena wpływu zdarzeń pyłowych na występowanie odry w zachodnich Chinach.Środowisko atmosferyczne.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Zintegrowany model do przewidywania atmosferycznego rozprzestrzeniania się wirusa pryszczycy Epidemiol.Infekować., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. New Directions: Airborne Transmission of pryszczyca, środowisko atmosferyczne, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Szybkość osadzania się wirusów i bakterii powyżej atmosferycznej warstwy granicznej.Dziennik ISME.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Badanie podłużne mikrobiomu związanego z cząstkami stałymi w megamieście.Biologia genomu.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Transmisja powietrzna mogła mieć
odegrały rolę w rozprzestrzenianiu się ognisk wysoce zjadliwej grypy ptaków w Stanach Zjednoczonych w 2015 r.nauka
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Ocena wpływu zdarzeń pyłowych na występowanie odry w zachodnich Chinach.Środowisko atmosferyczne.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Zoptymalizowana ekstrakcja DNA i sekwencjonowanie metagenomiczne społeczności drobnoustrojów w powietrzu .Nat.Protokół10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Kolekcja, wielkość cząstek i wykrywanie wirusów przenoszonych drogą powietrzną.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, opis produktu, dostępny pod adresem: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, opis produktu dostępny pod adresem: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Wykrywanie nowego koronawirusa 2019 (2019-nCoV) metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym.Eurosurveillance, 25(3), dostępne pod adresem: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Oryginał: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Czas postu: 18-04-2020