Je známo, že závažný akutní respirační syndrom známý jako onemocnění COVID-19 – způsobený virem SARS-CoV-2 – se šíří prostřednictvím respiračních kapének a blízkých kontaktů.[1]Zátěž COVID-19 byla extrémně závažná v Lombardii a Pádské nížině (severní Itálie),[2] oblasti vyznačující se vysokými koncentracemi pevných částic, o kterých je již známo, že mají negativní účinky na lidské zdraví.[3]Regionální údaje dostupné pro Itálii k datu 12. dubna ukazují, že asi 30 % aktuálně pozitivních lidí stále žije v Lombardii (asi 40 %, vezmeme-li v úvahu celkový počet potvrzených případů od začátku epidemie), následuje Emilia Romagna (13,5 %) , Piemont (10,5 %) a Veneto (10 %).[2]Tyto čtyři oblasti Pádské nížiny představují 80 % celkových úmrtí zaznamenaných v Itálii a 65 % přijatých na jednotky intenzivní péče.[2]
Zdá se, že výzkum provedený Harvardskou školou veřejného zdraví potvrzuje souvislost mezi zvýšením koncentrací PM a úmrtností v důsledku COVID-19 v USA[4] V předchozích sděleních jsme předpokládali možnost, že SARS-CoV-2 virus by mohl být přítomen na částicích (PM) během šíření infekce,[5,6] v souladu s již existujícími důkazy
k dispozici pro jiné viry.[7-15] Problematika mikrobiomu spojených s PM ve vzduchu, zejména v městském prostředí, však zůstává do značné míry nedostatečně prozkoumána[16] a – v současnosti – dosud nikdo neprovedl experimentální studie specificky zaměřené při potvrzení nebo vyloučení přítomnosti SARS-CoV-2 na PM.
Zde uvádíme první výsledky analýz, které jsme provedli na 34 vzorcích PM10 venkovních/vzdušných PM10 z průmyslového areálu v provincii Bergamo, odebraných dvěma různými vzorkovači vzduchu po dobu 3 týdnů, od 21. února do března. 13.
Podle metodologie popsané Panem et al.v roce 2019 (pro sběr, stanovení velikosti částic a detekci virů přenášených vzduchem)[17] vzorky PM byly odebírány na křemenných vláknových filtrech pomocí nízkoobjemového gravimetrického vzorkovače vzduchu (38,3 l/min po dobu 23 h), v souladu s referenční metodou EN12341 :2014 pro monitorování PM10.Částice byly zachyceny na filtrech s typickým 99,9 %.zadržování aerosolu, řádně skladováno a dodáno do laboratoře aplikované a komparativní genomiky univerzity v Terstu.Vzhledem k „environmentální“ povaze vzorku, pravděpodobně bohatého na inhibitory DNA polymeráz, jsme přistoupili k extrakci RNA za použití soupravy Quick RNA pro fekální půdní mikroby přizpůsobené typu filtrů.[18]Poloviční filtr byl srolován tak, aby horní strana směřovala dovnitř,v polypropylenové zkumavce o objemu 5 ml spolu s kuličkami dodanými v sadě.Z počátečního 1 ml lyzačního pufru jsme byli schopni získat asi 400 ul roztoku, který byl poté zpracován podle standardních protokolů, což vedlo k finálnímu eluátu 15 ul.Následně bylo 5 ul použito pro testování SARS-CoV-2.Vzhledem ke konkrétnímu původu vzorku byl použit qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Systémy amplifikace byly ty z protokolu vyvinutého Cormanem et al, publikovaného na webových stránkách WHO [20].
Test byl výslovně zaměřen na potvrzení nebo vyloučení přítomnosti RNA SARS-CoV-2 na částicích.První analýza použila „gen E“ jako molekulární marker a přinesla působivý pozitivní výsledek na 15 ze 16 filtrů, i když, jak jsme mohli očekávat, Ct bylo mezi 36-38 cykly.
Poté jsme replikovali analýzu na 6 pozitivních filtrech (již pozitivních na „gen E“) pomocí „genu RtDR“ jako molekulárního markeru – který je vysoce specifický pro SARS-CoV-2 – a dosáhli jsme 5 významných výsledků. pozitivity;úspěšně byly provedeny i kontrolní testy k vyloučení falešné pozitivity (obr. 1).
Aby se předešlo vyčerpání vzácného dostupného materiálu pro odběr vzorků, byly zbývající extrahované RNA dodány do místní univerzitní nemocnice (jedno z klinických center autorizovaných italskou vládou pro diagnostické testy SARS-CoV-2), aby bylo možné provést druhý test. paralelní slepý test.Tato druhá klinická laboratoř testovala 34 extrakcí RNA pro geny E, N a RdRP, přičemž uváděla 7 pozitivních výsledků pro alespoň jeden ze tří markerových genů, přičemž pozitivita byla potvrzena samostatně pro všechny tři markery (obr. 2).Vzhledem k povaze vzorku a vzhledem k tomu, že odběr vzorků nebyl proveden pro klinické diagnostické účely, ale pro testy znečištění životního prostředí (s přihlédnutím také k tomu, že filtry byly před molekulárně genetickými analýzami skladovány alespoň čtyři týdny, protožev důsledku italské odstávky), můžeme potvrdit, že jsme přiměřeně prokázali přítomnost virové RNA SARS-CoV-2 detekcí vysoce specifického „genu RtDR“ na 8 filtrech.Kvůli nedostatku dalších materiálů z filtrů jsme však nebyli schopni zopakovat dostatečný počet testů, abychom prokázali pozitivitu pro všechny 3 molekulární markery současně.
Toto je první předběžný důkaz, že SARS-CoV-2 RNA může být přítomna na venkovních částicích, což naznačuje, že v podmínkách atmosférické stability a vysokých koncentrací PM by SARS-CoV-2 mohl vytvářet klastry s venkovními PM a – snížení jejich difúzního koeficientu – zvýšení perzistence viru v atmosféře.Další potvrzení tohoto předběžnéhodůkazy probíhají a měly by zahrnovat posouzení v reálném čase o vitalitě SARS-CoV-2 a také o jeho virulenci, když je adsorbován na částicích.V současné době nelze učinit žádné předpoklady týkající se korelace mezi přítomností viru na PM a progresí propuknutí COVID-19.Další problémy, které je třeba konkrétně řešit, jsou průměrné koncentrace částicnezbytný pro potenciální „posilující účinek“ nákazy (v případě, že se potvrdí, že PM by mohly působit jako „přenašeče“ virových kapénkových jader), nebo dokonce pro teoretickou možnost imunizace v důsledku vystavení minimální dávce při nižších prahových hodnotách PM .
Obr. 1 Amplifikační křivky genů E (A) a RdRP (B): zelené čáry představují testované filtry;křížové čárypředstavuje referenční filtrační extrakce;červené čáry představují amplifikaci pozitivních vzorků.
Obr.2.Pozitivní výsledky (označené X) pro geny E, N a RdRP získané pro celý vzorek 34 PM10filtry testované ve druhé paralelní analýze.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco A Piscitelli8, Prisco A Piscitelli8
1. Katedra průmyslové chemie, Univerzita v Bologni, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Itálie
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Meziresortní centrum průmyslového výzkumu „Obnovitelné zdroje, životní prostředí, modrý růst, energie“,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Katedra biologie, Univerzita „Aldo Moro“ v Bari, Bari, Itálie
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Katedra chemických a farmaceutických věd, Univerzita v Terstu, Terst, Itálie
e-mail: barbierp@units.it
5. Divize environmentálního výzkumu, TCR TECORA, Milán, Itálie
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Katedra přírodních věd – Univerzita v Terstu, Terst, Itálie
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Divize laboratorní medicíny, Univerzitní nemocnice Giuliano Isontina (ASU GI), Terst, Itálie
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italská společnost environmentální medicíny (SIMA), Milán, Itálie
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Katedra environmentálních věd a poicy, Univerzita v Miláně, Milán, Itálie
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Odpovídající autor:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Reference
1. Světová zdravotnická organizace, Způsoby přenosu viru způsobujícího COVID-19: důsledky pro preventivní doporučení IPC, Vědecké sdělení;k dispozici na: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29. března 2020)
2. Italské ministerstvo zdravotnictví, denní bulletin propuknutí Covid-19 v Itálii, dostupný na http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Evropská agentura pro životní prostředí, Zpráva o kvalitě ovzduší v Evropě 2019;č. 10/2019;Evropská agentura pro životní prostředí: Kodaň, Dánsko, k dispozici na: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Vystavení znečištění ovzduší a úmrtnost na COVID-19 ve Spojených státech, dostupné na: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italská společnost environmentální medicíny (SIMA), Position Paper Particulate Matter a COVID-19,
k dispozici na: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Existuje věrohodná role pro částice při šíření COVID-19 v severní Itálii?, BMJ Rapid Responses, 8. dubna 2020, dostupné na: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generace virem ptačí chřipky (AIV) kontaminovaná fekálními jemnými částicemi (PM2,5): detekce genomu a infekčnosti a výpočet imise.Veterinární mikrobiologie.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Přenos vzduchem mohl hrát roli v šíření ohnisek vysoce patogenní ptačí chřipky v roce 2015 v Spojené státy.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Hodnocení vlivu prachových událostí na výskyt spalniček v západní Číně.Atmosférické prostředí.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Integrovaný model pro předpověď šíření viru slintavky a kulhavky Epidemiol v atmosféře.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. New Directions: Airborne Transmission of Foot-and-Mouth Disease Virus Atmospheric Environment, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Rychlosti depozice virů a bakterií nad hraniční vrstvou atmosféry.ISME Journal.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Podélný průzkum mikrobiomu spojeného s částicemi v megaměstě.Biologie genomu.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Vzdušný přenos může mít
hrál roli v šíření ohnisek vysoce patogenní ptačí chřipky ve Spojených státech v roce 2015.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Hodnocení dopadu prašných událostí na výskyt spalniček v západní Číně.Atmosférické prostředí.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Optimalizovaná extrakce DNA a metagenomické sekvenování vzdušných mikrobiálních společenstev .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednický, JA, Wu, C.-Y., Sběr, stanovení velikosti částic a detekce vzdušných virů.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, popis produktu, dostupný na: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, popis produktu, dostupný na: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Detekce nového koronaviru 2019 (2019-nCoV) pomocí RT-PCR v reálném čase.Eurosurveillance, 25(3), dostupné na:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Originál: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Čas odeslání: 18. dubna 2020