Je známo, že těžký akutní respirační syndrom známý jako onemocnění COVID-19 – způsobený virem SARS-CoV-2 – se šíří kapénkami z dýchacích cest a blízkými kontakty.[1] Zátěž COVID-19 byla extrémně závažná v Lombardii a Pádské nížině (severní Itálie),[2] oblasti charakterizované vysokými koncentracemi pevných částic, o nichž je již známo, že mají negativní účinky na lidské zdraví.[3] Regionální údaje dostupné pro Itálii k 12. dubnu ukazují, že v Lombardii stále žije přibližně 30 % aktuálně pozitivních lidí (přibližně 40 %, pokud vezmeme v úvahu celkový počet případů potvrzených od začátku epidemie), následovaná Emilií Romagnou (13,5 %), Piemontem (10,5 %) a Benátskem (10 %).[2] Tyto čtyři regiony Pádské nížiny představují 80 % všech úmrtí zaznamenaných v Itálii a 65 % hospitalizací na jednotkách intenzivní péče.[2]
Výzkum provedený Harvard School of Public Health zřejmě potvrzuje souvislost mezi zvýšením koncentrací PM a úmrtností v důsledku COVID-19 v USA[4]. V předchozích sděleních jsme vyslovili hypotézu o možnosti, že by virus SARS-CoV-2 mohl být přítomen na pevných částicích (PM) během šíření infekce[5,6], což je v souladu s již existujícími důkazy.
dostupné pro jiné viry.[7-15] Problematika mikrobiomu spojeného s PM ve vzduchu, zejména v městském prostředí, však zůstává do značné míry nedostatečně prozkoumána,[16] a – v současné době – nikdo neprovedl experimentální studie konkrétně zaměřené na potvrzení nebo vyloučení přítomnosti SARS-CoV-2 na PM.
Zde prezentujeme první výsledky analýz, které jsme provedli na 34 vzorcích PM10 venkovních/vzdušných částic PM10 z průmyslového areálu v provincii Bergamo, odebraných dvěma různými vzorkovači vzduchu po dobu 3 týdnů, od 21. února do 13. března.
V souladu s metodikou popsanou Panem a kol. v roce 2019 (pro sběr, stanovení velikosti částic a detekci virů přenášených vzduchem)[17] byly vzorky PM odebrány na křemenných vláknitých filtrech pomocí nízkoobjemového gravimetrického vzorkovače vzduchu (38,3 l/min po dobu 23 hodin), který je v souladu s referenční metodou EN12341:2014 pro monitorování PM10. Částice byly zachyceny na filtrech s typickou účinností 99,9 %.zadržování aerosolu, řádně skladováno a doručeno do laboratoře Aplikované a srovnávací genomiky Terstské univerzity. Vzhledem k „environmentální“ povaze vzorku, pravděpodobně bohatého na inhibitory DNA polymeráz, jsme přistoupili k extrakci RNA pomocí soupravy Quick RNA fecal soil mikrobe kit přizpůsobené typu filtrů.[18] Polovina filtru byla srolována horní stranou dovnitř,v 5ml polypropylenové zkumavce spolu s kuličkami dodanými v soupravě. Z počátečního 1 ml lyzačního pufru jsme byli schopni získat přibližně 400 µl roztoku, který byl následně zpracován dle definice ve standardních protokolech, což vedlo k finálnímu eluátu o objemu 15 µl. Následně bylo 5 µl použito pro testování SARS-CoV-2. Vzhledem ke specifickému původu vzorku byl použit qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19] Amplifikační systémy byly dle protokolu vyvinutého Cormanem a kol., zveřejněného na webových stránkách WHO [20].
Test byl explicitně zaměřen na potvrzení nebo vyloučení přítomnosti RNA SARS-CoV-2 na pevných částicích. První analýza použila „gen E“ jako molekulární marker a přinesla působivý pozitivní výsledek na 15 z 16 filtrů, i když, jak se dalo očekávat, Ct byla mezi 36-38 cykly.
Poté jsme analýzu replikovali na 6 pozitivních filtrech (již pozitivních na „gen E“) s použitím „genu RtDR“ jako molekulárního markeru – který je vysoce specifický pro SARS-CoV-2 – a dosáhli jsme tak 5 významných pozitivit; úspěšně byly provedeny i kontrolní testy k vyloučení falešné pozitivity (obr. 1).
Aby se předešlo vyčerpání dostupného vzácného vzorkovacího materiálu, byly zbývající extrahované RNA doručeny do místní univerzitní nemocnice (jednoho z klinických center autorizovaných italskou vládou pro diagnostické testy SARS-CoV-2) za účelem provedení druhého paralelního slepého testu. Tato druhá klinická laboratoř testovala 34 extrakcí RNA pro geny E, N a RdRP a vykázala 7 pozitivních výsledků pro alespoň jeden ze tří markerových genů, přičemž pozitivita byla samostatně potvrzena pro všechny tři markery (obr. 2). Vzhledem k povaze vzorku a vzhledem k tomu, že odběr vzorků nebyl proveden pro klinicko-diagnostické účely, ale pro testy znečištění životního prostředí (s přihlédnutím k tomu, že filtry byly skladovány alespoň čtyři týdny před molekulárně genetickými analýzami, protože(v důsledku uzavření Itálie) můžeme potvrdit, že jsme dostatečně prokázali přítomnost virové RNA SARS-CoV-2 detekcí vysoce specifického „genu RtDR“ na 8 filtrech. Vzhledem k nedostatku dalších materiálů z filtrů jsme však nebyli schopni zopakovat dostatečný počet testů, abychom prokázali pozitivitu všech 3 molekulárních markerů současně.
Toto je první předběžný důkaz, že RNA SARS-CoV-2 může být přítomna na venkovních pevných částicích, což naznačuje, že v podmínkách atmosférické stability a vysokých koncentrací PM by SARS-CoV-2 mohl vytvářet shluky s venkovními PM a – snížením jejich difuzního koeficientu – zvyšovat perzistenci viru v atmosféře. Další potvrzení tohoto předběžnéhoDůkazy probíhají a měly by zahrnovat hodnocení vitality viru SARS-CoV-2 v reálném čase a také jeho virulence při adsorpci na částice. V současné době nelze činit žádné předpoklady ohledně korelace mezi přítomností viru na PM a progresí epidemie COVID-19. Dalšími otázkami, které je třeba konkrétně řešit, jsou průměrné koncentrace PM v konečném důsledku.potřebné pro potenciální „zesilovací účinek“ nákazy (v případě, že se potvrdí, že PM by mohl působit jako „nosič“ jader virových kapének), nebo dokonce teoretická možnost imunizace v důsledku minimální expozice dávkám při nižších prahových hodnotách PM.
Obr. 1 Amplifikační křivky genů E (A) a RdRP (B): zelené čáry představují testované filtry; křížové čárypředstavuje extrakce referenčního filtru; červené čáry představují amplifikaci pozitivních vzorků.
Obr. 2. Pozitivní výsledky (označené X) pro geny E, N a RdRP získané u všech 34 vzorků PM10filtry testované v druhých paralelních analýzách.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco A Piscitelli8, Prisco A Piscitelli8
1. Katedra průmyslové chemie, Univerzita v Bologni, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Itálie
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Meziresortní centrum pro průmyslový výzkum „Obnovitelné zdroje, životní prostředí, modrý růst, energie“,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Katedra biologie, Univerzita „Aldo Moro“ v Bari, Bari, Itálie
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Katedra chemických a farmaceutických věd, Univerzita v Terstu, Terst, Itálie
e-mail: barbierp@units.it
5. Divize environmentálního výzkumu, TCR TECORA, Milán, Itálie
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Katedra biologických věd – Univerzita v Terstu, Terst, Itálie
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Divize laboratorní medicíny, Univerzitní nemocnice Giuliano Isontina (ASU GI), Terst, Itálie
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italská společnost environmentální medicíny (SIMA), Milán, Itálie
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Katedra environmentálních věd a politiky, Univerzita v Miláně, Milán, Itálie
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Odpovídající autor:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Reference
1. Světová zdravotnická organizace, Způsoby přenosu viru způsobujícího COVID-19: důsledky pro doporučení preventivních opatření v rámci IPC, Vědecký přehled; dostupné na adrese: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29. března 2020)
2. Italské ministerstvo zdravotnictví, denní bulletin o vypuknutí onemocnění Covid-19 v Itálii, dostupné na adrese http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Evropská agentura pro životní prostředí, Zpráva o kvalitě ovzduší v Evropě za rok 2019; č. 10/2019; Evropská agentura pro životní prostředí: Kodaň, Dánsko, dostupné na adrese: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Vystavení znečištění ovzduší a úmrtnost na COVID-19 ve Spojených státech, dostupné na adrese: https://projects.iq.harvard.edu/files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italská společnost environmentální medicíny (SIMA), Stanovisko k tématu Částice a COVID-19,
dostupné na adrese: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Existuje pravděpodobná role částic při šíření COVID-19, duben 2008 v severní Itálii, k dispozici? na: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Tvorba jemných částic (PM2,5) kontaminovaných virem ptačí chřipky (AIV): detekce genomu a infekčnosti a výpočet imise. Veterinary Microbiology. 139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Vzdušný přenos mohl hrát roli v šíření vysoce patogenní ptačí chřipky v roce 2015 ve Spojených státech. Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Hodnocení dopadu prašných událostí na výskyt spalniček v západní Číně. Atmospheric Environment. 157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Integrovaný model pro predikci atmosférického šíření viru slintavky a kulhavky Epidemiol. Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Nové směry: Přenos viru slintavky a kulhavky vzduchem Atmospheric Environment, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Rychlosti ukládání virů a bakterií nad mezní vrstvou atmosféry. The ISME Journal. 12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Longitudinální průzkum mikrobiomu spojeného s částicemi ve velkoměstě. Genome Biology. 21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Vzdušný přenos mohl mít
sehrál roli v šíření vysoce patogenní ptačí chřipky v roce 2015 ve Spojených státech. Sci
Zpráva 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Hodnocení dopadu prašných událostí na výskyt spalniček v západní Číně. Atmospheric Environment. 157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Optimalizovaná extrakce DNA a metagenomické sekvenování mikrobiálních společenstev přenášených vzduchem. Nat. Protoc. 10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Sběr, stanovení velikosti částic a detekce virů přenášených vzduchem. Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ltd, popis produktu, dostupný na adrese: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, popis produktu, dostupný na adrese: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Detekce nového koronaviru z roku 2019 (2019-nCoV) pomocí RT-PCR v reálném čase. Eurosurveillance, 25(3), dostupné na adrese: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Originál: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Čas zveřejnění: 18. dubna 2020
