Sabe-se que a síndrome respiratória aguda grave conhecida como doença de COVID-19, devido ao vírus SARS-CoV-2, se espalha por gotículas respiratórias e contatos próximos.[1]A carga do COVID-19 foi extremamente grave na Lombardia e no Vale do Pó (norte da Itália),[2] uma área caracterizada por altas concentrações de material particulado, que já são conhecidos por produzir efeitos negativos na saúde humana.[3]Os números regionais disponíveis para a Itália na data de 12 de abril mostram que cerca de 30% das pessoas atualmente positivas ainda vivem na Lombardia (cerca de 40% se considerarmos o total de casos confirmados desde o início da epidemia), seguida pela Emilia Romagna (13,5%) , Piemonte (10,5%) e Veneto (10%).[2]Essas quatro regiões do Vale do Pó representam 80% do total de mortes registradas na Itália e 65% das internações em Unidades de Terapia Intensiva.[2]
Uma pesquisa realizada pela Harvard School of Public Health parece confirmar uma associação entre aumentos nas concentrações de PM e taxas de mortalidade por COVID-19 nos EUA[4] Em comunicações anteriores, levantamos a hipótese de que SARS-CoV-2 o vírus pode estar presente no material particulado (PM) durante a disseminação da infecção,[5,6] de forma consistente com as evidências já
disponível para outros vírus.[7-15] No entanto, a questão do microbioma associado ao PM no ar, especialmente em ambientes urbanos, permanece amplamente subinvestigada,[16] e - no momento - ninguém ainda realizou estudos experimentais especificamente direcionados em confirmar ou excluir a presença do SARS-CoV-2 no PM.
Aqui, apresentamos os primeiros resultados das análises que realizamos em 34 amostras de PM10 de PM10 ao ar livre/transportadas de um local industrial da província de Bergamo, coletadas com dois amostradores de ar diferentes durante um período contínuo de 3 semanas, de 21 de fevereiro a março 13º.
Seguindo a metodologia descrita por Pan et al.em 2019 (para a coleta, dimensionamento de partículas e detecção de vírus transportados pelo ar),[17] amostras de PM foram coletadas em filtros de fibra de quartzo usando um amostrador de ar gravimétrico de baixo volume (38,3 l/min por 23 h), compatível com o método de referência EN12341 :2014 para monitoramento PM10.O material particulado ficou preso nos filtros com 99,9% deretenção de aerossóis, devidamente armazenados e entregues ao laboratório de Genômica Aplicada e Comparada da Universidade de Trieste.Dada a natureza “ambiental” da amostra, presumivelmente rica em inibidores de DNA polimerases, procedeu-se à extracção de RNA utilizando o kit Quick RNA fecal solo microbe adaptado ao tipo de filtros.[18]Meio filtro foi enrolado, com o lado superior voltado para dentro,em tubo de polipropileno de 5 ml, junto com as esferas fornecidas no kit.Do 1 ml inicial de lysisbuffer, conseguimos obter cerca de 400 ul de solução, que foi processada conforme definido pelos protocolos padrão, resultando em um eluato final de 15 ul.Posteriormente, 5 ul foram usados para o teste SARS-CoV-2.Dada a origem particular da amostra, o qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix foi usado.[19]Os sistemas de amplificação foram os do protocolo desenvolvido por Corman et al, publicado no site da OMS [20].
O teste visava explicitamente confirmar ou excluir a presença do RNA do SARS-CoV-2 no material particulado.A primeira análise usou o “gene E” como marcador molecular e produziu um resultado positivo impressionante em 15 dos 16 filtros, mesmo que, como poderíamos esperar, o Ct estivesse entre 36-38 ciclos.
Depois disso, replicamos a análise em 6 dos filtros positivos (já positivos para o “gene E”) usando o “gene RtDR” como marcador molecular – altamente específico para SARS-CoV-2 – alcançando 5 resultados significativos de positividade;testes de controle para excluir falsa positividade também foram realizados com sucesso (fig. 1).
Para evitar o esgotamento do escasso material de amostragem disponível, os RNAs extraídos restantes foram entregues ao Hospital Universitário local (um dos centros clínicos autorizados pelo governo italiano para testes de diagnóstico de SARS-CoV-2), a fim de realizar um segundo teste paralelo cego.Este segundo laboratório clínico testou 34 extrações de RNA para os genes E, N e RdRP, reportando 7 resultados positivos para pelo menos um dos três genes marcadores, com positividade confirmada separadamente para todos os três marcadores (Fig. 2).Pela natureza da amostra, e considerando que a amostragem não foi realizada para fins de diagnóstico clínico, mas para testes de poluição ambiental (levando em conta também que os filtros foram armazenados por pelo menos quatro semanas antes de serem submetidos a análises de genética molecular, comouma consequência da paralisação italiana), podemos confirmar que demonstramos razoavelmente a presença do RNA viral do SARS-CoV-2 ao detectar o “gene RtDR” altamente específico em 8 filtros.No entanto, devido à falta de materiais adicionais dos filtros, não conseguimos repetir um número suficiente de testes para mostrar positividade para todos os 3 marcadores moleculares simultaneamente.
Esta é a primeira evidência preliminar de que o RNA do SARS-CoV-2 pode estar presente em material particulado ao ar livre, sugerindo assim que, em condições de estabilidade atmosférica e altas concentrações de PM, o SARS-CoV-2 poderia criar aglomerados com PM ao ar livre e – por reduzindo seu coeficiente de difusão – aumentam a persistência do vírus na atmosfera.Outras confirmações desta preliminaras evidências estão em andamento e devem incluir avaliação em tempo real sobre a vitalidade do SARS-CoV-2, bem como sua virulência quando adsorvido em material particulado.No momento, nenhuma suposição pode ser feita sobre a correlação entre a presença do vírus no PM e a progressão do surto de COVID-19.Outras questões a serem abordadas especificamente são as concentrações médias de PM eventualmentenecessária para um potencial “efeito boost” do contágio (caso se confirme que o PM possa atuar como “portador” dos núcleos de gotículas virais), ou mesmo a possibilidade teórica de imunização decorrente de exposições a doses mínimas em limiares mais baixos de PM .
Fig.1 Curvas de amplificação dos genes E (A) e RdRP (B): as linhas verdes representam os filtros testados;linhas cruzadasrepresenta extrações de filtro de referência;as linhas vermelhas representam a amplificação das amostras positivas.
Figura 2.Resultados positivos (marcados com X) para os genes E, N e RdRP obtidos para todas as 34 amostras PM10filtros testados nas segundas análises paralelas.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, Alessandro Miani8,9
1. Dept. Química Industrial, Universidade de Bolonha, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bolonha, Itália
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Centro Interdepartamental de Pesquisa Industrial “Fontes Renováveis, Meio Ambiente, Crescimento Azul, Energia”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Departamento de Biologia, Universidade “Aldo Moro” de Bari, Bari, Itália
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Departamento de Ciências Químicas e Farmacêuticas, Universidade de Trieste, Trieste, Itália
e-mail: barbierp@units.it
5. Divisão de Pesquisa Ambiental, TCR TECORA, Milão, Itália
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Departamento de Ciências da Vida – Universidade de Trieste, Trieste, Itália
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Divisão de Medicina Laboratorial, Hospital Universitário Giuliano Isontina (ASU GI), Trieste, Itália
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Sociedade Italiana de Medicina Ambiental (SIMA), Milão, Itália
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Departamento de Ciência Ambiental e Política, Universidade de Milão, Milão, Itália
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Autor correspondente:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Referências
1. Organização Mundial da Saúde, Modos de transmissão do vírus causador da COVID-19: implicações para recomendações de precaução IPC, Resumo científico;disponível em: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 de março de 2020)
2. Ministério da Saúde italiano, boletim diário sobre o surto de Covid-19 na Itália, disponível em http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Agência Ambiental Europeia, Relatório de Qualidade do Ar na Europa 2019;Nº 10/2019;Agência Europeia do Ambiente: Copenhaga, Dinamarca, disponível em: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Exposição à poluição do ar e mortalidade por COVID-19 nos Estados Unidos, disponível em: https://projects.iq.harvard.edu/ arquivos/covid-pm/arquivos/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Sociedade Italiana de Medicina Ambiental (SIMA), Documento de Posicionamento sobre Matéria Particulada e COVID-19,
disponível em: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Existe um papel plausível for Particulate Matter in the spread of COVID-19 in Northern Italy?, BMJ Rapid Responses, 8 de abril de 2020, disponível em: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Geração de material particulado fino fecal contaminado com vírus da influenza aviária (AIV) (PM2.5): detecção de genoma e infecciosidade e cálculo de imissão.Microbiologia Veterinária.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. A transmissão aérea pode ter desempenhado um papel na disseminação dos surtos de gripe aviária altamente patogênica em 2015 no Estados Unidos.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Avaliação do impacto de eventos de poeira na incidência de sarampo no oeste da China.Ambiente Atmosférico.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Um modelo integrado para prever a propagação atmosférica do vírus da febre aftosa Epidemiol.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Novas Direções: Transmissão Aérea do Vírus da Febre Aftosa Ambiente Atmosférico, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Taxas de deposição de vírus e bactérias acima da camada limite atmosférica.O jornal ISME.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Levantamento longitudinal do microbioma associado ao material particulado em uma megacidade.Biologia Genômica.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. A transmissão aérea pode ter
desempenhou um papel importante na disseminação dos surtos de gripe aviária altamente patogênica em 2015 nos Estados Unidos.ciência
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Avaliação do impacto de eventos de poeira na incidência de sarampo no oeste da China.Ambiente Atmosférico.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Extração de DNA otimizada e sequenciamento metagenômico de comunidades microbianas transportadas pelo ar .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Coleção, dimensionamento de partículas e detecção de vírus transportados pelo ar.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, descrição do produto, disponível em: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, descrição do produto, disponível em: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Detecção do novo coronavírus 2019 (2019-nCoV) por RT-PCR em tempo real.Eurosurveillance, 25(3), disponível em:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Original: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Horário de postagem: 18 de abril de 2020