Тяжелый острый респираторный синдром, известный как заболевание COVID-19, вызванное вирусом SARS-CoV-2, как известно, распространяется воздушно-капельным путем и через тесные контакты.[1] Бремя COVID-19 было чрезвычайно тяжелым в Ломбардии и долине реки По (Северная Италия)[2], районе, характеризующемся высокой концентрацией твердых частиц, которые, как известно, оказывают негативное воздействие на здоровье человека.[3] Региональные данные, доступные по Италии на дату 12 апреля, показывают, что около 30% в настоящее время положительных людей по-прежнему проживают в Ломбардии (около 40%, если учитывать общее количество случаев, подтвержденных с начала эпидемии), за которой следуют Эмилия-Романья (13,5%), Пьемонт (10,5%) и Венето (10%).[2] На эти четыре региона долины реки По приходится 80% от общего числа зарегистрированных случаев смерти в Италии и 65% госпитализаций в отделения интенсивной терапии.[2]
Исследование, проведенное Гарвардской школой общественного здравоохранения, по-видимому, подтверждает связь между повышением концентрации PM и уровнем смертности из-за COVID-19 в США[4]. В предыдущих сообщениях мы выдвинули гипотезу о возможности присутствия вируса SARS-CoV-2 на твердых частицах (PM) во время распространения инфекции[5,6], что согласуется с уже имеющимися доказательствами.
доступны для других вирусов.[7-15] Однако вопрос микробиома, связанного с твердыми частицами в воздухе, особенно в городских условиях, остается в значительной степени недостаточно изученным,[16] и – в настоящее время – никто еще не проводил экспериментальных исследований, специально направленных на подтверждение или исключение присутствия SARS-CoV-2 в твердых частицах.
Здесь мы представляем первые результаты анализов, которые мы провели на 34 образцах PM10, содержащихся в воздухе и на открытом воздухе, с промышленного объекта в провинции Бергамо, собранных с помощью двух различных пробоотборников воздуха в течение непрерывного трехнедельного периода с 21 февраля по 13 марта.
Следуя методологии, описанной Паном и др. в 2019 году (для сбора, определения размера частиц и обнаружения вирусов в воздухе),[17] образцы PM собирались на фильтрах из кварцевого волокна с использованием малообъемного гравиметрического пробоотборника воздуха (38,3 л/мин в течение 23 ч), соответствующего эталонному методу EN12341:2014 для мониторинга PM10. Твердые частицы улавливались на фильтрах с типичным показателем 99,9%аэрозольное удержание, надлежащим образом сохраненное и доставленное в лабораторию прикладной и сравнительной геномики Триестского университета. Учитывая «экологическую» природу образца, предположительно богатого ингибиторами ДНК-полимераз, мы приступили к извлечению РНК с помощью набора Quick RNA fecal soil microbe kit, адаптированного к типу фильтров.[18] Половина фильтра была свернута, верхняя сторона обращена внутрь,в полипропиленовой пробирке объемом 5 мл вместе с шариками, входящими в комплект. Из исходного 1 мл лизирующего буфера нам удалось получить около 400 мкл раствора, который затем обрабатывали в соответствии со стандартными протоколами, в результате чего получали конечный элюат объемом 15 мкл. Впоследствии 5 мкл использовали для тестирования SARS-CoV-2. Учитывая особое происхождение образца, использовали qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19] Системы амплификации были такими же, как в протоколе, разработанном Корманом и др., опубликованном на веб-сайте ВОЗ [20].
Тест был явно направлен на подтверждение или исключение присутствия РНК SARS-CoV-2 на твердых частицах. Первый анализ использовал «ген E» в качестве молекулярного маркера и дал впечатляющий положительный результат на 15 из 16 фильтров, даже если, как мы могли ожидать, Ct находился между 36-38 циклами.
После этого мы повторили анализ на 6 положительных фильтрах (уже положительных по «гену E»), используя «ген RtDR» в качестве молекулярного маркера, который является высокоспецифичным для SARS-CoV-2, достигнув 5 значимых положительных результатов; контрольные тесты для исключения ложноположительных результатов также были успешно выполнены (рис. 1).
Чтобы избежать исчерпания дефицитного материала для отбора проб, оставшиеся извлеченные РНК были доставлены в местную университетскую больницу (один из клинических центров, уполномоченных итальянским правительством для диагностических тестов на SARS-CoV-2), чтобы провести второй параллельный слепой тест. Эта вторая клиническая лаборатория проверила 34 выделения РНК для генов E, N и RdRP, сообщив о 7 положительных результатах по крайней мере для одного из трех генов-маркеров, причем положительность была подтверждена отдельно для всех трех маркеров (рис. 2). Из-за характера образца и учитывая, что отбор проб проводился не для клинических диагностических целей, а для испытаний на загрязнение окружающей среды (принимая во внимание также, что фильтры хранились не менее четырех недель до проведения молекулярно-генетических анализов, как(вследствие итальянского закрытия) мы можем подтвердить, что обоснованно продемонстрировали наличие вирусной РНК SARS-CoV-2, обнаружив высокоспецифичный «ген RtDR» на 8 фильтрах. Однако из-за отсутствия дополнительных материалов из фильтров мы не смогли повторить достаточное количество тестов, чтобы показать позитивность для всех 3 молекулярных маркеров одновременно.
Это первое предварительное доказательство того, что РНК SARS-CoV-2 может присутствовать на внешних твердых частицах, что позволяет предположить, что в условиях атмосферной стабильности и высоких концентраций PM SARS-CoV-2 может создавать кластеры с внешними PM и — за счет снижения их коэффициента диффузии — усиливать устойчивость вируса в атмосфере. Дальнейшие подтверждения этого предварительногоДанные продолжают поступать и должны включать оценку в реальном времени жизнеспособности SARS-CoV-2, а также его вирулентности при адсорбции на твердых частицах. В настоящее время нельзя сделать никаких предположений относительно корреляции между присутствием вируса на PM и прогрессированием вспышки COVID-19. Другие вопросы, которые следует рассмотреть конкретно, — это средние концентрации PM в конечном итогетребуется для потенциального «усиливающего эффекта» заражения (в случае подтверждения того, что PM может выступать в качестве «носителя» ядер вирусных капель), или даже теоретической возможности иммунизации в результате воздействия минимальных доз при более низких порогах PM.
Рис.1 Кривые амплификации генов E (A) и RdRP (B): зеленые линии представляют собой протестированные фильтры; перекрестные линиипредставляет собой экстракцию контрольного фильтра; красные линии представляют собой амплификацию положительных образцов.
Рис. 2. Положительные результаты (отмечены знаком X) для генов E, N и RdRP, полученные для всех 34 образцов PM10фильтры, протестированные во втором параллельном анализе.
Леонардо Сетти1, Фабрицио Пассарини2, Джанлуиджи Де Дженнаро3, Пьерлуиджи Барбьери4, Мария Грация Перроне5, Массимо Борелли6, Джоланда Пальмисани3, Алессия Ди Джилио3, Валентина Торболи6, Альберто Паллавичини6, Маурицио Русчо7, Приско Писцителли8, Алессандро Миани8,9
1. Кафедра промышленной химии, Болонский университет, Виале дель Рисорджименто – 4, I-40136, Болонья, Италия
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Межведомственный центр промышленных исследований «Возобновляемые источники, экология, голубой рост, энергетика»,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Кафедра биологии, Университет «Альдо Моро» в Бари, Бари, Италия
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Кафедра химических и фармацевтических наук, Университет Триеста, Триест, Италия
e-mail: barbierp@units.it
5. Отдел исследований окружающей среды, TCR TECORA, Милан, Италия
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Кафедра естественных наук – Университет Триеста, Триест, Италия
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Отделение лабораторной медицины, Университетская больница Джулиано Изонтина (ASU GI), Триест, Италия.
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Итальянское общество экологической медицины (SIMA), Милан, Италия
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Кафедра наук об окружающей среде и политике, Миланский университет, Милан, Италия
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Автор-корреспондент:
Леонардо Сетти, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Ссылки
1. Всемирная организация здравоохранения, Пути передачи вируса, вызывающего COVID-19: последствия для рекомендаций по мерам предосторожности IPC, Научный обзор; доступно по адресу: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 марта 2020 г.)
2. Министерство здравоохранения Италии, ежедневный бюллетень о вспышке COVID-19 в Италии, доступен по адресу http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. ЕАОС, Европейское агентство по охране окружающей среды, Отчет о качестве воздуха в Европе за 2019 год; № 10/2019; Европейское агентство по охране окружающей среды: Копенгаген, Дания, доступно по адресу: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Сяо Ву, Рэйчел С. Нетери, М. Бенджамин Сабат, Даниэль Браун, Франческа Доминичи, Воздействие загрязнения воздуха и смертность от COVID-19 в Соединенных Штатах, доступно по адресу: https://projects.iq.harvard.edu/files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Итальянское общество экологической медицины (SIMA), Аналитическая записка «Твердые частицы и COVID-19»,
доступно по адресу: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Сетти Л., Пассарини Ф., Де Дженнаро Г., Барбьери П., Перроне М.Г., Пьяццалунга А., Борелли М., Пальмисани Дж., Ди Джилио А., Писцителли П., Миани А., Существует ли правдоподобная роль твердых частиц в распространении COVID-19 в Северной Италии?, BMJ Rapid Responses, 8 апреля 2020 г., доступно по адресу: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Генерация фекальных мелких частиц (PM2.5), загрязненных вирусом птичьего гриппа (AIV): обнаружение генома и инфекционности и расчет иммиссии. Ветеринарная микробиология. 139, 156-164 (2009)
8. Чжао, И., Ричардсон, Б., Такле, Э., Чай, Л., Шмитт, Д., Вин, Х. Воздушно-капельный путь передачи мог сыграть роль в распространении вспышек высокопатогенного птичьего гриппа в США в 2015 году. Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Оценка влияния пылевых событий на заболеваемость корью в западном Китае. Атмосферная среда. 157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Интегрированная модель для прогнозирования распространения вируса ящура в атмосфере Epidemiol. Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Глостера, Дж., Александерсен, С. Новые направления: Воздушная передача вируса ящура. Атмосферная среда, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Рече, И., Д'Орта, Г., Младенов, Н., Вингет, Д.М., Саттл, К.А. Скорости осаждения вирусов и бактерий выше пограничного слоя атмосферы. Журнал ISME. 12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Лонгитюдное исследование микробиома, связанного с твердыми частицами в мегаполисе. Геномная биология. 21, 55 (2020)
14. Чжао, И., Ричардсон, Б., Такле, Э., Чай, Л., Шмитт, Д., Вин, Х. Воздушно-капельная передача может иметь
сыграли роль в распространении вспышек высокопатогенного птичьего гриппа в Соединенных Штатах в 2015 году. Sci
Отчет 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Оценка влияния пылевых событий на заболеваемость корью в западном Китае. Атмосферная среда. 157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Оптимизированное извлечение ДНК и метагеномное секвенирование микробных сообществ в воздухе. Nat. Protoc. 10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Сбор, определение размера частиц и обнаружение вирусов, передающихся воздушно-капельным путем. Журнал прикладной микробиологии, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, описание продукта, доступно по адресу: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, описание продукта доступно по адресу: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Корман В.М., Ландт О., Кайзер М., Моленкамп Р., Мейер А., Чу Д.К. и Малдерс Д.Г. (2020).
Выявление нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Eurosurveillance, 25(3), доступно по адресу:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Оригинал: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Время публикации: 18 апр. 2020 г.
