Alvorlig akutt respiratorisk syndrom kjent som COVID-19-sykdom – forårsaket av SARS-CoV-2-viruset – spres via dråper i luftveiene og nærkontakt.[1] COVID-19-byrden var ekstremt alvorlig i Lombardia og Po-dalen (Nord-Italia),[2] et område preget av høye konsentrasjoner av partikler, som allerede er kjent for å ha negative effekter på menneskers helse.[3] Regionale tall tilgjengelig for Italia per 12. april viser at omtrent 30 % av de nåværende positive personene fortsatt bor i Lombardia (omtrent 40 % hvis man tar i betraktning de totale tilfellene som er bekreftet fra begynnelsen av epidemien), etterfulgt av Emilia Romagna (13,5 %), Piemonte (10,5 %) og Veneto (10 %).[2] Disse fire regionene i Po-dalen står for 80 % av de totale dødsfallene som er registrert i Italia og 65 % av innleggelsene på intensivavdelinger.[2]
En forskning utført av Harvard School of Public Health ser ut til å bekrefte en sammenheng mellom økning i PM-konsentrasjoner og dødelighet på grunn av COVID-19 i USA[4]. I tidligere kommunikasjon har vi antatt at SARS-CoV-2-viruset kan være tilstede på partikler (PM) under spredningen av infeksjonen[5,6], i samsvar med bevis som allerede finnes.
tilgjengelig for andre virus.[7-15] Imidlertid er spørsmålet om luftbåren PM-assosiert mikrobiom, spesielt i urbane miljøer, fortsatt i stor grad underutforsket,[16] og – for øyeblikket – har ingen fortsatt utført eksperimentelle studier som spesifikt har som mål å bekrefte eller utelukke tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 på PM.
Her presenterer vi de første resultatene av analysene vi har utført på 34 PM10-prøver av utendørs/luftbåren PM10 fra et industriområde i Bergamo-provinsen, samlet inn med to forskjellige luftprøvetakere over en sammenhengende periode på 3 uker, fra 21. februar til 13. mars.
I henhold til metodikken beskrevet av Pan et al. i 2019 (for innsamling, partikkelstørrelsesbestemmelse og deteksjon av luftbårne virus),[17] ble PM-prøver samlet inn på kvartsfiberfiltre ved hjelp av en gravimetrisk luftprøvetaker med lavt volum (38,3 l/min i 23 timer), i samsvar med referansemetoden EN12341:2014 for PM10-overvåking. Partikler ble fanget på filtre med 99,9 % typiskeaerosolretensjon, riktig lagret og levert til laboratoriet for anvendt og komparativ genomikk ved Trieste universitet. Gitt prøvens "miljømessige" natur, antagelig rik på hemmere av DNA-polymeraser, fortsatte vi med ekstraksjonen av RNA ved å bruke Quick RNA fecal soil microbe kit tilpasset filtertypen.[18] Halvfilteret ble rullet sammen, med oversiden vendt innover,i et 5 ml polypropylenrør, sammen med kulene som fulgte med i settet. Fra den første 1 ml lysisbufferen klarte vi å få omtrent 400 µl løsning, som deretter ble behandlet som definert av standardprotokollene, noe som resulterte i et endelig eluat på 15 µl. Deretter ble 5 µl brukt til SARS-CoV-2-testing. Gitt prøvens spesielle opprinnelse ble qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix brukt.[19] Amplifiseringssystemene var de samme som i protokollen utviklet av Corman et al., publisert på WHOs nettsted [20].
Testen hadde eksplisitt som mål å bekrefte eller utelukke tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 RNA på partikler. Den første analysen brukte «E-genet» som en molekylær markør og ga et imponerende positivt resultat på 15 av 16 filtre, selv om Ct, som forventet, var mellom 36–38 sykluser.
Etter det har vi replikert analysen på 6 av de positive filtrene (allerede positive for «E-genet») ved å bruke «RtDR-genet» som en molekylær markør – som er svært spesifikt for SARS-CoV-2 – og oppnådd 5 signifikante positive resultater. Kontrolltester for å utelukke falsk positivitet ble også utført med hell (fig. 1).
For å unngå at det knappe prøvematerialet som var tilgjengelig, ble de gjenværende ekstraherte RNA-ene levert til det lokale universitetssykehuset (et av de kliniske sentrene som er autorisert av den italienske regjeringen for SARS-CoV-2-diagnostiske tester), for å utføre en andre parallell blindtest. Dette andre kliniske laboratoriet testet 34 RNA-ekstraksjoner for E-, N- og RdRP-genene, og rapporterte 7 positive resultater for minst ett av de tre markørgenene, med positivitet bekreftet separat for alle tre markørene (fig. 2). På grunn av prøvens art, og med tanke på at prøvetakingen ikke ble utført for kliniske diagnostiske formål, men for miljøforurensningstester (også tatt i betraktning at filtrene ble lagret i minst fire uker før de ble gjennomgått molekylærgenetiske analyser), ettersom(en konsekvens av den italienske nedstengningen), kan vi bekrefte at vi har påvist tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 viralt RNA på en rimelig måte ved å detektere svært spesifikt «RtDR-gen» på 8 filtre. På grunn av mangel på tilleggsmaterialer fra filtrene var vi imidlertid ikke i stand til å gjenta nok tester til å vise positivitet for alle de 3 molekylære markørene samtidig.
Dette er det første foreløpige beviset på at SARS-CoV-2 RNA kan være tilstede på utendørs partikler, noe som tyder på at SARS-CoV-2, under forhold med atmosfærisk stabilitet og høye konsentrasjoner av PM, kan skape klynger med utendørs PM og – ved å redusere diffusjonskoeffisienten – øke virusets persistens i atmosfæren. Ytterligere bekreftelser av dette foreløpigeDet pågår stadig forskning, og det bør inkludere sanntidsvurderinger av SARS-CoV-2s vitalitet samt virulens når det absorberes på partikler. For øyeblikket kan det ikke gjøres noen antagelser om sammenhengen mellom virusets tilstedeværelse på PM og utviklingen av COVID-19-utbruddet. Andre problemstillinger som skal tas opp spesifikt, er de gjennomsnittlige konsentrasjonene av PM til slutt.nødvendig for en potensiell «boost-effekt» av smitten (i tilfelle det bekreftes at PM kan fungere som en «bærer» for de virale dråpekjernene), eller til og med den teoretiske muligheten for immunisering som følge av minimale doseeksponeringer ved lavere terskler for PM.
Fig. 1 Amplifikasjonskurver for E (A) og RdRP-gener (B): grønne linjer representerer testede filtre; krysslinjerrepresenterer referansefilterekstraksjoner; røde linjer representerer amplifikasjonen av de positive prøvene.
Fig. 2. Positive resultater (merket med X) for E-, N- og RdRP-gener oppnådd for alle 34 PM10-prøvenefiltre testet i de andre parallelle analysene.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, A9andro
1. Institutt for industriell kjemi, Universitetet i Bologna, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italia
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Tverrfaglig senter for industriell forskning «Fornybare kilder, miljø, blå vekst, energi»
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Institutt for biologi, Universitetet «Aldo Moro» i Bari, Bari, Italia
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Institutt for kjemiske og farmasøytiske vitenskaper, Universitetet i Trieste, Trieste, Italia
e-mail: barbierp@units.it
5. Avdeling for miljøforskning, TCR TECORA, Milano, Italia
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Institutt for biovitenskap – Universitetet i Trieste, Trieste, Italia
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Avdeling for laboratoriemedisin, Universitetssykehuset Giuliano Isontina (ASU GI), Trieste, Italia
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italiensk forening for miljømedisin (SIMA), Milano, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Institutt for miljøvitenskap og -politikk, Universitetet i Milano, Milano, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Korresponderende forfatter:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Referanser
1. Verdens helseorganisasjon, Overføringsmåter for virus som forårsaker COVID-19: implikasjoner for IPC-forholdsregler, Vitenskapelig brief; tilgjengelig på: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29. mars 2020)
2. Det italienske helsedepartementet, daglig bulletin om Covid-19-utbruddet i Italia, tilgjengelig på http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Det europeiske miljøbyrået, Rapport om luftkvalitet i Europa 2019; nr. 10/2019; Det europeiske miljøbyrået: København, Danmark, tilgjengelig på: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Eksponering for luftforurensning og COVID-19-dødelighet i USA, tilgjengelig på: https://projects.iq.harvard.edu/files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italiensk forening for miljømedisin (SIMA), posisjonsdokument om partikler og COVID-19,
tilgjengelig på: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Er det en plausibel rolle for partikulært materiale i spredningen av COVID-19 i Northern Rapid 0, BMJ 0, 8 april, Italia, april 2000? på: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generering av avføringsfinpartikler (PM2.5) kontaminert med fugleinfluensavirus (AIV): genom- og infeksjonsdeteksjon og beregning av immisjon. Veterinary Microbiology. 139, 156–164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Luftbåren smitte kan ha spilt en rolle i spredningen av utbrudd av høypatogen fugleinfluensa i USA i 2015. Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Vurdering av virkningen av støvhendelser på meslingeforekomsten i Vest-Kina. Atmosfærisk miljø. 157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI En integrert modell for å forutsi atmosfærisk spredning av munn- og klovsykevirus Epidemiol. Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Nye retninger: Luftbåren overføring av munn- og klovsykevirus Atmosfærisk miljø, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Avsetningsrater for virus og bakterier over det atmosfæriske grenselaget. The ISME Journal. 12, 1154–1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Longitudinell undersøkelse av mikrobiom assosiert med partikler i en megaby. Genome Biology. 21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Luftbåren overføring kan ha
spilte en rolle i spredningen av utbrudd av høypatogen fugleinfluensa i USA i 2015. Vitenskap
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Vurdering av virkningen av støvhendelser på meslingeforekomsten i Vest-Kina. Atmosfærisk miljø. 157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Optimalisert DNA-ekstraksjon og metagenomisk sekvensering av luftbårne mikrobielle samfunn. Nat. Protoc. 10, 768–779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Innsamling, partikkelstørrelsesbestemmelse og deteksjon av luftbårne virus. Journal of Applied Microbiology, 127, 1596–1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, produktbeskrivelse, tilgjengelig på: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, beskrivelse av produktet, tilgjengelig på: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Påvisning av det nye koronaviruset i 2019 (2019-nCoV) ved hjelp av sanntids RT-PCR. Eurosurveillance, 25(3), tilgjengelig på: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Opprinnelig: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Publisert: 18. april 2020
