Ernstig acuut respiratoir syndroom, bekend als COVID-19-ziekte – veroorzaakt door het SARS-CoV-2-virus – verspreidt zich naar verluidt via ademhalingsdruppeltjes en nauwe contacten.[1] De last van COVID-19 was extreem zwaar in Lombardije en de Povlakte (Noord-Italië),[2] een gebied dat wordt gekenmerkt door hoge concentraties fijnstof, waarvan al bekend is dat ze negatieve effecten hebben op de menselijke gezondheid.[3] Regionale cijfers die beschikbaar zijn voor Italië op 12 april laten zien dat ongeveer 30% van de momenteel positieve mensen nog steeds in Lombardije woont (ongeveer 40% als rekening wordt gehouden met het totale aantal gevallen dat is bevestigd vanaf het begin van de epidemie), gevolgd door Emilia Romagna (13,5%), Piemonte (10,5%) en Veneto (10%).[2] Deze vier regio's van de Povlakte zijn goed voor 80% van het totale aantal geregistreerde sterfgevallen in Italië en 65% van de opnames op de intensive care.[2]
Uit onderzoek van de Harvard School of Public Health blijkt dat er een verband bestaat tussen de toename van de concentraties fijnstof en de sterftecijfers als gevolg van COVID-19 in de VS. [4] In eerdere berichten hebben we de hypothese geopperd dat het SARS-CoV-2-virus aanwezig zou kunnen zijn op fijnstof (PM) tijdens de verspreiding van de infectie, [5, 6] in overeenstemming met het bewijsmateriaal dat al beschikbaar is.
beschikbaar voor andere virussen.[7-15] De kwestie van het in de lucht aanwezige PM-geassocieerde microbioom, vooral in stedelijke omgevingen, blijft echter grotendeels onderbelicht,[16] en – op dit moment – heeft niemand nog experimentele studies uitgevoerd die specifiek gericht zijn op het bevestigen of uitsluiten van de aanwezigheid van SARS-CoV-2 op PM.
Hier presenteren we de eerste resultaten van de analyses die we hebben uitgevoerd op 34 PM10-monsters van PM10 uit de buitenlucht/in de lucht, afkomstig van een industriële locatie in de provincie Bergamo. Deze monsters zijn verzameld met twee verschillende luchtmonsternemers gedurende een aaneengesloten periode van 3 weken, van 21 februari tot en met 13 maart.
Volgens de methodologie beschreven door Pan et al. in 2019 (voor het verzamelen, bepalen van de deeltjesgrootte en detectie van in de lucht verspreide virussen),[17] werden PM-monsters verzameld op kwartsvezelfilters met behulp van een gravimetrische luchtmonsternemer met een laag volume (38,3 l/min gedurende 23 uur), in overeenstemming met de referentiemethode EN12341:2014 voor PM10-monitoring. Fijnstof werd op filters opgevangen met een typische 99,9%aerosolretentie, correct opgeslagen en geleverd aan het laboratorium voor Toegepaste en Vergelijkende Genomica van de Universiteit van Triëst. Gezien de "milieu"-aard van het monster, vermoedelijk rijk aan remmers van DNA-polymerasen, gingen we verder met de extractie van RNA met behulp van de Quick RNA fecale bodemmicrobekit, aangepast aan het type filters.[18] De helft van het filter werd opgerold, met de bovenkant naar binnen gericht,in een polypropyleenbuis van 5 ml, samen met de kralen die in de kit zijn meegeleverd. Van de eerste 1 ml lysisbuffer konden we ongeveer 400 µl oplossing verkrijgen, die vervolgens werd verwerkt zoals gedefinieerd in de standaardprotocollen, resulterend in een uiteindelijk eluaat van 15 µl. Vervolgens werd 5 µl gebruikt voor de SARS-CoV-2-test. Gezien de specifieke oorsprong van het monster werd de qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix gebruikt.[19] De amplificatiesystemen waren die van het protocol ontwikkeld door Corman et al, gepubliceerd op de WHO-website [20].
De test was expliciet gericht op het bevestigen of uitsluiten van de aanwezigheid van SARS-CoV-2 RNA op fijnstof. De eerste analyse gebruikte het "E-gen" als moleculaire marker en leverde een indrukwekkend positief resultaat op bij 15 van de 16 filters, zelfs als de Ct, zoals verwacht, tussen de 36 en 38 cycli lag.
Daarna hebben we de analyse herhaald op zes van de positieve filters (die al positief waren voor het "E-gen") door het "RtDR-gen" als moleculaire marker te gebruiken – wat zeer specifiek is voor SARS-CoV-2 – en zo vijf significante positieve resultaten behaald. Controletests om vals-positieve resultaten uit te sluiten werden ook succesvol uitgevoerd (Fig. 1).
Om te voorkomen dat het schaarse beschikbare monstermateriaal opraakt, werden de resterende geëxtraheerde RNA's afgeleverd bij het plaatselijke Universitair Ziekenhuis (een van de klinische centra die door de Italiaanse overheid zijn erkend voor diagnostische tests op SARS-CoV-2) om een tweede parallelle blinde test uit te voeren. Dit tweede klinische laboratorium testte 34 RNA-extracties op de E-, N- en RdRP-genen en rapporteerde 7 positieve resultaten voor ten minste één van de drie markergenen, met positiviteit afzonderlijk bevestigd voor alle drie de markergenen (Fig. 2). Gezien de aard van het monster en gezien het feit dat de monstername niet is uitgevoerd voor klinische diagnostische doeleinden, maar voor tests op milieuvervuiling (en rekening houdend met het feit dat filters ten minste vier weken werden bewaard voordat ze moleculair genetische analyses ondergingen, aangezien(als gevolg van de Italiaanse lockdown) kunnen we bevestigen dat we de aanwezigheid van viraal RNA van SARS-CoV-2 redelijkerwijs hebben aangetoond door het detecteren van een zeer specifiek "RtDR-gen" op 8 filters. Door het gebrek aan extra materiaal van de filters konden we echter niet voldoende tests herhalen om tegelijkertijd positief te zijn voor alle 3 moleculaire markers.
Dit is het eerste voorlopige bewijs dat SARS-CoV-2-RNA aanwezig kan zijn op fijnstof in de buitenlucht. Dit suggereert dat SARS-CoV-2, onder omstandigheden van atmosferische stabiliteit en hoge concentraties fijnstof, clusters met fijnstof in de buitenlucht zou kunnen vormen en – door hun diffusiecoëfficiënt te verlagen – de persistentie van het virus in de atmosfeer zou kunnen vergroten. Verdere bevestigingen van deze voorlopigeEr wordt voortdurend onderzoek gedaan naar de vitaliteit van SARS-CoV-2 en de virulentie ervan bij adsorbtie aan fijnstof. Momenteel kunnen er geen aannames worden gedaan over de correlatie tussen de aanwezigheid van het virus op fijnstof en de voortgang van de COVID-19-uitbraak. Andere kwesties die specifiek moeten worden aangepakt, zijn de gemiddelde concentraties fijnstof uiteindelijk.vereist voor een mogelijk 'boost-effect' van de besmetting (in het geval dat bevestigd wordt dat PM zou kunnen fungeren als een 'drager' voor de virale druppelkernen), of zelfs de theoretische mogelijkheid van immunisatie als gevolg van minimale blootstelling aan doses bij lagere drempelwaarden voor PM.
Figuur 1 Amplificatiecurven van E (A) en RdRP-genen (B): groene lijnen geven geteste filters weer; kruislijnengeeft de referentiefilterextracties weer; rode lijnen geven de amplificatie van de positieve monsters weer.
Figuur 2. Positieve resultaten (gemarkeerd met X) voor E-, N- en RdRP-genen verkregen voor alle 34 PM10-monstersfilters getest in de tweede parallelle analyses.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, Alessandro Miani8,9
1. Afdeling Industriële Chemie, Universiteit van Bologna, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italië
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Interdepartementaal Centrum voor Industrieel Onderzoek “Hernieuwbare bronnen, Milieu, Blauwe groei, Energie”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Afdeling Biologie, Universiteit “Aldo Moro” van Bari, Bari, Italië
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Afdeling Chemische en Farmaceutische Wetenschappen, Universiteit van Triëst, Triëst, Italië
e-mail: barbierp@units.it
5. Afdeling Milieuonderzoek, TCR TECORA, Milaan, Italië
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Afdeling Levenswetenschappen – Universiteit van Triëst, Triëst, Italië
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Afdeling Laboratoriumgeneeskunde, Universitair Ziekenhuis Giuliano Isontina (ASU GI), Triëst, Italië
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italiaanse Vereniging voor Milieugeneeskunde (SIMA), Milaan, Italië
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Afdeling Milieuwetenschappen en -beleid, Universiteit van Milaan, Milaan, Italië
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Corresponderende auteur:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Referenties
1. Wereldgezondheidsorganisatie, Wijzen van overdracht van het virus dat COVID-19 veroorzaakt: implicaties voor de voorzorgsmaatregelen van het IPC, Wetenschappelijk rapport; beschikbaar op: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 maart 2020)
2. Italiaans Ministerie van Volksgezondheid, dagelijks bulletin Covid-19-uitbraak in Italië, beschikbaar op http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Europees Milieuagentschap, Luchtkwaliteit in Europa 2019 Rapport; nr. 10/2019; Europees Milieuagentschap: Kopenhagen, Denemarken, beschikbaar op: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Blootstelling aan luchtvervuiling en COVID-19-sterfte in de Verenigde Staten, beschikbaar op: https://projects.iq.harvard.edu/files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italiaanse Vereniging voor Milieugeneeskunde (SIMA), Standpuntbepaling Fijnstof en COVID-19,
beschikbaar op: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Is er een plausibele rol voor fijn stof in de verspreiding van COVID-19 in Noord-Italië?, BMJ Rapid Responses, 8 april 2020, beschikbaar op: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generatie van met aviair influenzavirus (AIV) besmet fijnstof (PM2.5) in de feces: detectie van genoom en besmettelijkheid en berekening van de immissie. Veterinary Microbiology. 139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Luchtoverdracht heeft mogelijk een rol gespeeld bij de verspreiding van de uitbraken van zeer pathogene vogelgriep in 2015 in de Verenigde Staten. Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Beoordeling van de impact van stofgebeurtenissen op de incidentie van mazelen in West-China. Atmospheric Environment. 157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Een geïntegreerd model om de atmosferische verspreiding van het mond-en-klauwzeervirus te voorspellen Epidemiol. Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Nieuwe richtingen: Luchtgedragen overdracht van mond-en-klauwzeervirus Atmosferische omgeving, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Depositiesnelheden van virussen en bacteriën boven de atmosferische grenslaag. The ISME Journal. 12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Longitudinaal onderzoek van het microbioom geassocieerd met fijnstof in een megastad. Genome Biology. 21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Luchttransmissie kan
speelde een rol bij de verspreiding van de uitbraken van zeer pathogene vogelgriep in 2015 in de Verenigde Staten. Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Beoordeling van de impact van stofgebeurtenissen op de incidentie van mazelen in West-China. Atmospheric Environment. 157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Geoptimaliseerde DNA-extractie en metagenomische sequentiebepaling van microbiële gemeenschappen in de lucht. Nat. Protoc. 10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Verzameling, deeltjesgroottebepaling en detectie van in de lucht verspreide virussen. Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, productbeschrijving, beschikbaar op: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, beschrijving van het product, beschikbaar op: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Detectie van het nieuwe coronavirus uit 2019 (2019-nCoV) door middel van realtime RT-PCR. Eurosurveillance, 25(3), beschikbaar op: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Origineel: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Plaatsingstijd: 18 april 2020
