イタリア北部のベルガモの粒子状物質で見つかった SARS-Cov-2 RNA: 最初の予備的証拠

SARS-CoV-2 ウイルスによる COVID-19 疾患として知られる重度の急性呼吸器症候群は、呼吸飛沫や密接な接触を介して広がることが認識されています。COVID-19 の負荷は、ロンバルディア州とポー渓谷 (北イタリア) で非常に深刻でした。[2] この地域は、人間の健康に悪影響を与えることが既に知られている粒子状物質の濃度が高いことを特徴としています。[3]4 月 12 日の時点でイタリアで入手可能な地域別の数値によると、現在陽性の人の約 30% がまだロンバルディア州に住んでおり (流行の最初から確認された全体の症例を考慮すると約 40%)、続いてエミリア・ロマーニャ (13.5%) が続きます。 、ピエモンテ (10.5%)、ベネト (10%) [2]。ポー渓谷のこれら 4 つの地域は、イタリアで記録された総死亡者数の 80% と、集中治療室への入院患者数の 65% を占めています。

ハーバード大学公衆衛生大学院が実施した調査では、米国における PM 濃度の増加と COVID-19 による死亡率との関連性が確認されているようです[4] 以前のコミュニケーションでは、SARS-CoV-2ウイルスは、感染の拡大中に粒子状物質 (PM) に存在する可能性があり [5,6]、すでに証拠と一致しています。
[7-15] しかし、特に都市環境における空気中の PM 関連マイクロバイオームの問題は、ほとんど調査されていないままであり [16]、現在のところ、具体的に目的とした実験的研究はまだ実施されていません。 PM上のSARS-CoV-2の存在を確認または除外する際。
ここでは、2 月 21 日から 3 月までの連続した 3 週間にわたって 2 つの異なる空気サンプラーで収集された、ベルガモ州の工業用地からの屋外/空中 PM10 の 34 個の PM10 サンプルに対して実行した分析の最初の結果を示します。 13日。
パンらによって説明された方法論に従います。2019 年 (空気中のウイルスの収集、粒子サイズ測定、および検出用) [17] 参照メソッド EN12341 に準拠した、低容量の重力式空気サンプラー (23 時間で 38.3 l/分) を使用して、PM サンプルを石英繊維フィルターで収集しました。 :2014 年 PM10 モニタリング。粒子状物質は、99.9% の標準値でフィルターに捕捉されましたエアロゾル保持、適切に保管され、トリエステ大学の応用および比較ゲノミクスの研究室に届けられました。おそらくDNAポリメラーゼの阻害剤が豊富なサンプルの「環境的」性質を考慮して、フィルターのタイプに適合したQuick RNA糞便土壌微生物キットを使用してRNAの抽出を進めました.[18]半分のフィルターは、上側が内側になるように丸めて、キットに含まれるビーズと一緒に、5 ml のポリプロピレン チューブに入れます。最初の 1 ml の溶解バッファーから、約 400 ul の溶液を得ることができました。これを標準プロトコールに従って処理し、最終的に 15 ul の溶出液を得ました。その後、5 ul を SARS-CoV-2 テストに使用しました。サンプルの特定の起源を考慮して、qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix が使用されました。増幅システムは、Corman らによって開発され、WHO のウェブサイトで公開されたプロトコルのものでした [20]。
このテストは、粒子状物質上の SARS-CoV-2 RNA の存在を確認または除外することを明示的に目的としていました。最初の分析では、分子マーカーとして「E 遺伝子」を使用し、予想どおり、Ct が 36 ~ 38 サイクルであったとしても、16 個のフィルターのうち 15 個で印象的な陽性結果が得られました。
その後、SARS-CoV-2 に非常に特異的な「RtDR 遺伝子」を分子マーカーとして使用することにより、6 つの陽性フィルター (「E 遺伝子」にすでに陽性) の分析を再現し、5 つの有意な結果に達しました。陽性の;偽陽性を排除するための対照試験も成功裏に実施されました(図1)。
入手可能な希少なサンプリング材料が不足するのを避けるために、残りの抽出された RNA は、2 回目の検査を実施するために、地元の大学病院 (SARS-CoV-2 診断検査のためにイタリア政府によって認可された臨床センターの 1 つ) に届けられました。パラレルブラインドテスト.この 2 番目の臨床検査室では、E、N、および RdRP 遺伝子について 34 の RNA 抽出物をテストし、3 つのマーカー遺伝子のうち少なくとも 1 つについて 7 つの陽性結果を報告し、3 つのマーカーすべてについて個別に陽性が確認されました (図 2)。サンプルの性質上、サンプリングが臨床診断目的ではなく環境汚染検査のために行われたことを考慮すると (分子遺伝学的分析を受ける前にフィルターが少なくとも 4 週間保管されていたことも考慮に入れる必要があります。イタリアのシャットダウンの結果)、8つのフィルターで非常に特異的な「RtDR遺伝子」を検出することにより、SARS-CoV-2ウイルスRNAの存在を合理的に実証したことを確認できます.ただし、フィルターから追加の材料が不足しているため、3 つの分子マーカーすべてに対して同時に陽性を示すのに十分な数のテストを繰り返すことができませんでした。
これは、SARS-CoV-2 RNA が屋外の粒子状物質に存在する可能性があるという最初の予備的な証拠であり、したがって、大気が安定し、PM が高濃度の条件では、SARS-CoV-2 が屋外の PM とクラスターを作成し、それらの拡散係数を減らす - 大気中のウイルスの持続性を高めます。この予備のさらなる確認証拠は進行中であり、SARS-CoV-2 の活力と、粒子状物質に吸着したときの病原性に関するリアルタイムの評価を含める必要があります。現時点では、PM でのウイルスの存在と COVID-19 のアウトブレイクの進行との相関関係に関して、仮定を立てることはできません。特に対処すべき他の問題は、最終的に PM の平均濃度です。伝染の潜在的な「ブースト効果」(PMがウイルス飛沫核の「キャリア」として機能する可能性があることが確認された場合)、またはPMのより低いしきい値での最小用量曝露の結果としての免疫化の理論的可能性にさえ必要です.

図 1 E (A) および RdRP 遺伝子 (B) の増幅曲線: 緑色の線はテストされたフィルターを表します。クロスライン参照フィルター抽出を表します。赤い線は、陽性サンプルの増幅を表します。
図1

図2。34 の PM10 サンプルすべてで得られた E、N、および RdRP 遺伝子の陽性結果 (X でマーク)2 番目の並列分析でテストされたフィルター。
図2レオナルド・セッティ 1、ファブリツィオ・パッサリーニ 2、ジャンルイジ・デ・ジェンナーロ 3、ピエルルイジ・バルビエリ 4、マリア・グラツィア・ペローネ 5、マッシモ・ボレッリ 6、ヨランダ・パルミサーニ 3、アレッシア・ディ・ジリオ 3、ヴァレンティーナ・トルボリ 6、アルベルト・パラヴィチーニ 6、マウリツィオ・ルシオ 7、プリスコ・ピシテッリ 8、アレッサンドロ・ミアーニ 8,9
1. 工業化学科​​、ボローニャ大学、Viale del Risorgimento – 4、I-40136、ボローニャ、イタリア
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. 産業研究のための部門間センター「再生可能資源、環境、青い成長、エネルギー」、
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. 生物学科、バーリ大学「アルド モロ」、バーリ、イタリア
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. イタリア、トリエステ、トリエステ大学、化学・薬学科
e-mail: barbierp@units.it
5. 環境研究部門、TCR TECORA、ミラノ、イタリア
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. 生命科学科 – トリエステ大学、トリエステ、イタリア
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. イタリア、トリエステ、大学病院 Giuliano Isontina (ASU GI)、検査医学部門
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. イタリア環境医学会 (SIMA)、ミラノ、イタリア
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. イタリア、ミラノ、ミラノ大学、環境科学および政策学科
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
対応する著者:
レオナルド・セッティ Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it

参考文献
1. 世界保健機関、COVID-19 を引き起こすウイルスの伝播モード: IPC 予防策の推奨事項への影響、科学的概要;https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (2020 年 3 月 29 日)
2. イタリア保健省、イタリアでの Covid-19 発生日報、http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf で入手可能
3. EEA、欧州環境庁、ヨーロッパの大気質 2019 年レポート。いいえ 10/2019;欧州環境庁: コペンハーゲン、デンマーク、入手先: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu、Rachel C. Nethery、M. Benjamin Sabath、Danielle Braun、Francesca Dominici、米国における大気汚染への暴露と COVID-19 死亡率、https://projects.iq.harvard.edu/ で入手可能files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. イタリア環境医学会 (SIMA)、ポジションペーパー粒子状物質と COVID-19、
入手可能: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Is there a Plausible Roleイタリア北部での COVID-19 の拡散における粒子状物質について?、BMJ Rapid Responses、2020 年 4 月 8 日、https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses で入手可能
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. 鳥インフルエンザ ウイルス (AIV) 汚染された糞便微粒子 (PM2.5) の生成:ゲノムおよび感染性の検出と免疫の計算。獣医微生物学。139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y.、Richardson, B.、Takle, E.、Chai, L.、Schmitt, D.、Win, H. 空気感染は、2015 年の高病原性鳥インフルエンザのアウトブレイクの拡大に役割を果たした可能性があります。アメリカ。Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y.、Zhou, J.、Yang, S.、Zhao, Y.、Zheng, X. 中国西部における麻疹発生率に対する粉塵事象の影響の評価。大気環境。157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI 口蹄疫ウイルス Epidemiol の大気拡散を予測するための統合モデル。感染症、124、577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. 新しい方向性: 口蹄疫ウイルス大気環境の空気感染, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA 大気境界層の上のウイルスとバクテリアの沈着率。ISME ジャーナル。12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N.、Liang, P.、Wu, C.、Wang, G.、Xu, Q.、Xiong, X.、Wang, T.、Zolfo, M.、Segata, N.、Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF 大都市における粒子状物質に関連するマイクロバイオームの縦断的調査。ゲノム生物学。21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H.
2015 年に米国で発生した高病原性鳥インフルエンザの流行に一役買った。科学
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y.、Zhou, J.、Yang, S.、Zhao, Y.、Zheng, X. 中国西部における麻疹発生率に対する粉塵事象の影響の評価。大気環境。157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J.,Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF 空中浮遊微生物群集の最適化された DNA 抽出とメタゲノム配列決定.ナット。プロトコル。10, 768-779 (2015)
17. Pan, M.、Lednicky, JA、Wu, C.-Y.、収集、粒子サイズ測定、空中浮遊ウイルスの検出。応用微生物学ジャーナル、127、1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt、製品説明、https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit で入手可能
19. Quantabio Ltd、製品の説明、https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix で入手可能
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
リアルタイム RT-PCR による 2019 年の新型コロナウイルス (2019-nCoV) の検出。Eurosurveillance、25(3)、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/で入手可能

原文:https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995


投稿時間: Apr-18-2020