سندرم تنفسی حاد شدید معروف به بیماری کووید-19 - ناشی از ویروس SARS-CoV-2 - شناخته شده است که از طریق قطرات تنفسی و تماس های نزدیک منتشر می شود.[1]بار کووید-19 در لومباردی و دره پو (شمال ایتالیا) بسیار شدید بود، [2] منطقه ای که با غلظت بالای ذرات مشخص می شود، که قبلاً شناخته شده است که اثرات منفی بر سلامت انسان دارد.[3]ارقام منطقه ای موجود برای ایتالیا در تاریخ 12 آوریل نشان می دهد که حدود 30٪ از افراد مثبت در حال حاضر هنوز در لمباردی زندگی می کنند (حدود 40٪ اگر موارد کلی تایید شده از ابتدای اپیدمی را در نظر بگیریم)، و پس از آن امیلیا رومانیا (13.5٪) قرار دارد. ، پیمونت (10.5%) و ونتو (10%).[2]این چهار منطقه از دره پو 80 درصد از کل مرگ و میر ثبت شده در ایتالیا و 65 درصد از پذیرش در بخش مراقبت های ویژه را تشکیل می دهند.[2]
به نظر می رسد تحقیقی که توسط دانشکده بهداشت عمومی هاروارد انجام شده است، ارتباط بین افزایش غلظت PM و میزان مرگ و میر ناشی از COVID-19 در ایالات متحده را تأیید می کند[4] در ارتباطات قبلی، ما این احتمال را فرض کرده ایم که SARS-CoV-2 ویروس ممکن است روی ذرات معلق (PM) در طول گسترش عفونت وجود داشته باشد، [5،6] به طور ثابت با شواهد موجود
برای سایر ویروس‌ها در دسترس است.[7-15] با این حال، موضوع میکروبیوم مرتبط با PM در هوا، به‌ویژه در محیط‌های شهری، تا حد زیادی مورد بررسی قرار نگرفته است، [16] و – در حال حاضر – هیچ‌کس هنوز مطالعات تجربی را با هدف خاص انجام نداده است. در تأیید یا رد حضور SARS-CoV-2 در PM.
در اینجا، اولین نتایج آنالیزهایی را که روی 34 نمونه PM10 PM10 در فضای باز/هوا از یک سایت صنعتی در استان برگامو انجام داده‌ایم، که با دو نمونه‌برگر هوای مختلف در یک دوره 3 هفته‌ای مداوم، از 21 فوریه تا مارس جمع‌آوری شده‌اند، ارائه می‌کنیم. سیزدهم
پیروی از روش توصیف شده توسط پان و همکاران.در سال 2019 (برای جمع‌آوری، اندازه ذرات و تشخیص ویروس‌های موجود در هوا)، [17] نمونه‌های PM بر روی فیلترهای فیبر کوارتز با استفاده از نمونه‌برگر هوای وزنی کم حجم (38.3 لیتر در دقیقه برای 23 ساعت)، مطابق با روش مرجع EN12341 جمع‌آوری شد. :2014 برای مانیتورینگ PM10.ذرات معلق بر روی فیلترهایی با 99.9٪ معمولی به دام افتادندنگهداری آئروسل، به درستی ذخیره و به آزمایشگاه ژنومیک کاربردی و مقایسه ای دانشگاه تریست تحویل داده شد.با توجه به ماهیت "محیط‌زیستی" نمونه، که احتمالاً غنی از بازدارنده‌های DNA پلیمراز است، ما با استفاده از کیت میکروب خاک مدفوع Quick RNA که با نوع فیلترها سازگار است، استخراج RNA را انجام دادیم.[18]نیم فیلتر رول شد، با سمت بالا رو به داخل،در یک لوله پلی پروپیلن 5 میلی لیتری، همراه با مهره های ارائه شده در کیت.از 1 میلی لیتر اولیه لیزبافر، ما توانستیم حدود 400 ul محلول به دست آوریم، که سپس طبق پروتکل های استاندارد پردازش شد و منجر به شستشوی نهایی 15 ul شد.پس از آن، 5 ul برای آزمایش SARS-CoV-2 استفاده شد.با توجه به منشا خاص نمونه، qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix استفاده شد.[19]سیستم های تقویت پروتکل توسعه یافته توسط Corman و همکاران، منتشر شده در وب سایت WHO [20] بودند.
هدف این آزمایش صریحاً تأیید یا رد وجود RNA SARS-CoV-2 بر روی ذرات بود.اولین تجزیه و تحلیل از "ژن E" به عنوان یک نشانگر مولکولی استفاده کرد و نتیجه مثبت چشمگیری را در 15 فیلتر از 16 فیلتر ایجاد کرد، حتی اگر همانطور که می‌توانیم انتظار داشتیم Ct بین 36-38 سیکل باشد.
پس از آن، ما تجزیه و تحلیل را بر روی 6 فیلتر مثبت (که قبلاً به "ژن E" مثبت بود) با استفاده از "ژن RtDR" به عنوان یک نشانگر مولکولی - که بسیار ویژه برای SARS-CoV-2 است - تکرار کردیم و به 5 نتیجه قابل توجه رسیدیم. مثبت اندیشی؛تست های کنترلی برای حذف مثبت کاذب نیز با موفقیت انجام شد (شکل 1).
برای جلوگیری از تمام شدن مواد نمونه کمیاب موجود، RNA های استخراج شده باقیمانده به بیمارستان دانشگاه محلی (یکی از مراکز بالینی مجاز توسط دولت ایتالیا برای آزمایش های تشخیصی SARS-CoV-2) تحویل داده شدند تا آزمایش دوم انجام شود. تست کور موازیاین آزمایشگاه بالینی دوم، 34 استخراج RNA را برای ژن‌های E، N و RdRP آزمایش کرد، و 7 نتیجه مثبت را برای حداقل یکی از سه ژن نشانگر گزارش کرد، با مثبت بودن جداگانه برای هر سه نشانگر (شکل 2).به دلیل ماهیت نمونه، و با توجه به اینکه نمونه برداری برای اهداف تشخیصی بالینی انجام نشده است، بلکه برای آزمایش های آلودگی محیطی انجام شده است (با در نظر گرفتن اینکه فیلترها حداقل به مدت چهار هفته قبل از انجام آنالیزهای ژنتیکی مولکولی نگهداری می شدند.در نتیجه تعطیلی ایتالیا)، می‌توانیم تأیید کنیم که وجود RNA ویروسی SARS-CoV-2 را با شناسایی «ژن RtDR» بسیار اختصاصی در ۸ فیلتر به‌طور منطقی نشان داده‌ایم.با این حال، به دلیل عدم وجود مواد اضافی از فیلترها، ما قادر به تکرار تعداد کافی آزمایش برای نشان دادن مثبت بودن هر 3 نشانگر مولکولی به طور همزمان نبودیم.
این اولین شواهد اولیه است که نشان می‌دهد RNA SARS-CoV-2 می‌تواند روی ذرات ذرات فضای باز وجود داشته باشد، بنابراین نشان می‌دهد که در شرایط پایداری جوی و غلظت‌های بالای PM، SARS-CoV-2 می‌تواند خوشه‌هایی با PM در فضای باز و - توسط کاهش ضریب انتشار آنها - افزایش ماندگاری ویروس در جو.تاییدیه های بیشتر از این مقدماتیشواهد در حال انجام است و باید شامل ارزیابی همزمان در مورد حیاتی SARS-CoV-2 و همچنین بیماری زای آن هنگام جذب ذرات معلق باشد.در حال حاضر، هیچ فرضی در رابطه با همبستگی بین حضور ویروس در PM و پیشرفت شیوع کووید-19 وجود ندارد.مسائل دیگری که باید به طور خاص به آن پرداخته شود، میانگین غلظت PM در نهایت استبرای یک "اثر تقویت کننده" بالقوه سرایت لازم است (در صورتی که تایید شود که PM ممکن است به عنوان یک "حامل" برای هسته های قطرات ویروسی عمل کند)، یا حتی امکان تئوریک ایمن سازی در نتیجه قرار گرفتن در معرض حداقل دوز در آستانه های پایین تر PM .
شکل 1 منحنی های تقویت ژن های E (A) و RdRP (B): خطوط سبز فیلترهای آزمایش شده را نشان می دهند.خطوط متقاطعاستخراج فیلتر مرجع را نشان می دهد.خطوط قرمز نشان دهنده تقویت نمونه های مثبت است.
شکل 2.نتایج مثبت (با علامت X) برای ژن‌های E، N و RdRP به‌دست‌آمده برای تمام نمونه‌های 34 PM10فیلترهای آزمایش شده در تجزیه و تحلیل موازی دوم.
لئوناردو ستتی1، فابریزیو پاسارینی2، جیانلوئیجی دی جنارو3، پیرلوئیجی باربیری4، ماریا گرازیا پرونه5، ماسیمو بورلی6، جولاندا پالمیسانی3، آلسیا دی گیلیو3، والنتینا توربولی6، آلبرتو پالاویسینی6، مائوریزیو پریسکو 8 روسیو بیلسی7
1. گروه شیمی صنعتی، دانشگاه بولونیا، Viale del Risorgimento - 4، I-40136، بولونیا، ایتالیا
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. مرکز بین بخشی برای تحقیقات صنعتی "منابع تجدید پذیر، محیط زیست، رشد آبی، انرژی"،
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. گروه زیست شناسی، دانشگاه "آلدو مورو" باری، باری، ایتالیا
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. گروه علوم شیمی و دارویی، دانشگاه تریست، تریست، ایتالیا
e-mail: barbierp@units.it
5. بخش تحقیقات محیطی، TCR TECORA، میلان، ایتالیا
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. بخش علوم زیستی - دانشگاه تریست، تریست، ایتالیا
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. بخش پزشکی آزمایشگاهی، بیمارستان دانشگاهی جولیانو ایسونتینا (ASU GI)، تریست، ایتالیا
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. انجمن ایتالیایی پزشکی محیطی (SIMA)، میلان، ایتالیا
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. گروه علوم محیطی و پویسی، دانشگاه میلان، میلان، ایتالیا
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
نویسنده متناظر:
لئوناردو ستی، Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
منابع
1. سازمان بهداشت جهانی، روش‌های انتقال ویروس عامل COVID-19: پیامدهای توصیه‌های احتیاطی IPC، مختصر علمی.موجود در: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 مارس 2020)
2. وزارت بهداشت ایتالیا، بولتن روزانه شیوع کووید-19 در ایتالیا، موجود در http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA، آژانس محیط زیست اروپا، گزارش کیفیت هوا در اروپا 2019؛شماره 10/2019;آژانس محیط زیست اروپا: کپنهاگ، دانمارک، موجود در: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu، Rachel C. Nethery، M. Benjamin Sabath، Danielle Braun، Francesca Dominici، مواجهه با آلودگی هوا و مرگ و میر ناشی از COVID-19 در ایالات متحده، موجود در: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. انجمن ایتالیایی پزشکی محیطی (SIMA)، ذرات کاغذ و کووید-19،
موجود در: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L.، Passarini F.، De Gennaro G.، Barbieri P.، Perrone MG، Piazzalunga A.، Borelli M.، Palmisani J.، Di Gilio A.، Piscitelli P، Miani A.، آیا نقش قابل قبولی وجود دارد. برای ذرات معلق در گسترش COVID-19 در شمال ایتالیا؟، BMJ Rapid Responses، 8 آوریل 2020، موجود در: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. نسل ذرات ریز مدفوع آلوده به ویروس آنفولانزای مرغی (AIV) (PM2.5): ژنوم و تشخیص عفونت و محاسبه میزان انتقالمیکروبیولوژی دامپزشکی.139، 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. انتقال هوا ممکن است در گسترش شیوع بیماری آنفولانزای فوق حاد پرندگان در سال 2015 نقش داشته باشد. ایالات متحده.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. ارزیابی تأثیر رویدادهای گرد و غبار بر بروز سرخک در غرب چین.محیط جوی.157، 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI یک مدل یکپارچه برای پیش‌بینی گسترش جوی اپیدمیول ویروس تب برفکی.Infect., 124, 577-590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. New Directions: Airborne Transmission of Foot-and-Mouth Disease Virus Atmospheric Environment, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA نرخ رسوب ویروس ها و باکتری ها در بالای لایه مرزی جو.مجله ISME.12، 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H. ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF بررسی طولی میکروبیوم مرتبط با ذرات معلق در یک کلان شهر.زیست شناسی ژنوم.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. انتقال هوایی ممکن است داشته باشد
نقشی در گسترش شیوع آنفلوانزای فوق حاد پرندگان در سال 2015 در ایالات متحده داشت.علمی
شماره 9، 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. ارزیابی تأثیر رویدادهای گرد و غبار بر بروز سرخک در غرب چین.محیط جوی.157، 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF استخراج DNA بهینه و تعیین توالی متاژنومی جوامع میکروبی موجود در هوا .نات.پروتکل10، 768-779 (2015)
17. Pan، M.، Lednicky، JA، Wu، C.-Y.، مجموعه، اندازه ذرات و تشخیص ویروس های موجود در هوا.مجله میکروبیولوژی کاربردی، 127، 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt، توضیحات محصول، موجود در: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd، شرح محصول، موجود در: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman، VM، Landt، O.، Kaiser، M.، Molenkamp، R.، Meijer، A.، Chu، DK، و Mulders، DG (2020).
تشخیص کروناویروس جدید 2019 (2019-nCoV) توسط RT-PCR بلادرنگ.Eurosurveillance، 25(3)، موجود در:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
اصل: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
زمان ارسال: آوریل-18-2020