Βρέθηκε RNA SARS-Cov-2 σε σωματίδια του Μπέργκαμο στη Βόρεια Ιταλία: Πρώτη προκαταρκτική απόδειξη

Το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο γνωστό ως νόσος COVID-19 – λόγω του ιού SARS-CoV-2 – αναγνωρίζεται ότι εξαπλώνεται μέσω των αναπνευστικών σταγονιδίων και των στενών επαφών.[1]Το βάρος του COVID-19 ήταν εξαιρετικά σοβαρό στη Λομβαρδία και την Κοιλάδα του Πάδου (Βόρεια Ιταλία),[2] μια περιοχή που χαρακτηρίζεται από υψηλές συγκεντρώσεις σωματιδίων, τα οποία είναι ήδη γνωστό ότι έχουν αρνητικές επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία.[3]Τα περιφερειακά στοιχεία που ήταν διαθέσιμα για την Ιταλία την ημερομηνία της 12ης Απριλίου δείχνουν ότι περίπου το 30% των επί του παρόντος θετικών ατόμων εξακολουθεί να ζει στη Λομβαρδία (περίπου 40% αν ληφθούν υπόψη τα συνολικά κρούσματα που επιβεβαιώθηκαν από την αρχή της επιδημίας), ακολουθούμενη από την Emilia Romagna (13,5%) , Πιεμόντε (10,5%) και Βένετο (10%).[2]Αυτές οι τέσσερις περιοχές της κοιλάδας του Πάδου αντιπροσωπεύουν το 80% των συνολικών θανάτων που καταγράφηκαν στην Ιταλία και το 65% των εισαγωγών στις Μονάδες Εντατικής Θεραπείας.[2]

Μια έρευνα που διεξήχθη από τη Σχολή Δημόσιας Υγείας του Χάρβαρντ φαίνεται να επιβεβαιώνει μια συσχέτιση μεταξύ των αυξήσεων στις συγκεντρώσεις PM και των ποσοστών θνησιμότητας λόγω του COVID-19 στις ΗΠΑ[4] Σε προηγούμενες ανακοινώσεις, έχουμε υποθέσει την πιθανότητα ότι ο SARS-CoV-2 ο ιός θα μπορούσε να είναι παρών στα σωματίδια (PM) κατά τη διάρκεια της εξάπλωσης της λοίμωξης,[5,6] σύμφωνα με τα ήδη αποδεικτικά στοιχεία
διαθέσιμο για άλλους ιούς.[7-15] Ωστόσο, το ζήτημα του αερομεταφερόμενου μικροβιώματος που σχετίζεται με τα PM, ειδικά σε αστικά περιβάλλοντα, παραμένει σε μεγάλο βαθμό υπό διερεύνηση,[16] και –προς το παρόν– κανείς δεν έχει ακόμη πραγματοποιήσει πειραματικές μελέτες με συγκεκριμένο στόχο κατά την επιβεβαίωση ή τον αποκλεισμό της παρουσίας του SARS-CoV-2 στο PM.
Εδώ, παρουσιάζουμε τα πρώτα αποτελέσματα των αναλύσεων που πραγματοποιήσαμε σε 34 δείγματα PM10 υπαίθριων/αέριων PM10 από μια βιομηχανική περιοχή της επαρχίας Μπέργκαμο, που συλλέχθηκαν με δύο διαφορετικούς δειγματολήπτες αέρα σε μια συνεχή περίοδο 3 εβδομάδων, από τις 21 Φεβρουαρίου έως τον Μάρτιο. 13η.
Ακολουθώντας τη μεθοδολογία που περιγράφεται από τους Pan et al.το 2019 (για τη συλλογή, το μέγεθος σωματιδίων και την ανίχνευση αερομεταφερόμενων ιών), [17] συλλέχθηκαν δείγματα PM σε φίλτρα ινών χαλαζία με χρήση βαρυμετρικού δειγματολήπτη αέρα χαμηλού όγκου (38,3 l/min για 23 ώρες), σύμφωνα με τη μέθοδο αναφοράς EN12341 :2014 για παρακολούθηση PM10.Τα σωματίδια παγιδεύτηκαν σε φίλτρα με τυπικό ποσοστό 99,9%.κατακράτηση αερολύματος, αποθηκεύεται κατάλληλα και παραδίδεται στο εργαστήριο Εφαρμοσμένης και Συγκριτικής Γονιδιωματικής του Πανεπιστημίου της Τεργέστης.Δεδομένης της «περιβαλλοντικής» φύσης του δείγματος, πιθανώς πλούσιου σε αναστολείς των πολυμερασών DNA, προχωρήσαμε στην εξαγωγή RNA χρησιμοποιώντας το κιτ μικροβίων εδάφους κοπράνων Quick RNA προσαρμοσμένο στον τύπο των φίλτρων.[18]Το μισό φίλτρο τυλίχτηκε, με την επάνω πλευρά στραμμένη προς τα μέσα,σε σωληνάριο πολυπροπυλενίου των 5 ml, μαζί με τα σφαιρίδια που παρέχονται στο κιτ.Από το αρχικό 1 ml ρυθμιστικού λύσης, μπορέσαμε να λάβουμε περίπου 400 ul διαλύματος, το οποίο στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως ορίζεται από τα τυπικά πρωτόκολλα, με αποτέλεσμα ένα τελικό έκλουσμα 15 ul.Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκαν 5 ul για τη δοκιμή SARS-CoV-2.Δεδομένης της ιδιαίτερης προέλευσης του δείγματος, χρησιμοποιήθηκε το qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Τα συστήματα ενίσχυσης ήταν αυτά του πρωτοκόλλου που αναπτύχθηκε από τους Corman et al, που δημοσιεύτηκε στον ιστότοπο του ΠΟΥ [20].
Το τεστ αποσκοπούσε ρητά στην επιβεβαίωση ή τον αποκλεισμό της παρουσίας του RNA του SARS-CoV-2 σε σωματίδια.Η πρώτη ανάλυση χρησιμοποίησε το «γονίδιο Ε» ως μοριακό δείκτη και παρήγαγε ένα εντυπωσιακό θετικό αποτέλεσμα σε 15 από τα 16 φίλτρα, ακόμα κι αν, όπως θα μπορούσαμε να περιμέναμε, η Ct ήταν μεταξύ 36-38 κύκλων.
Μετά από αυτό, επαναλάβαμε την ανάλυση σε 6 από τα θετικά φίλτρα (ήδη θετικά στο «γονίδιο E») χρησιμοποιώντας το «γονίδιο RtDR» ως μοριακό δείκτη – το οποίο είναι εξαιρετικά ειδικό για το SARS-CoV-2 – φτάνοντας σε 5 σημαντικά αποτελέσματα της θετικότητας?Οι δοκιμές ελέγχου για τον αποκλεισμό ψευδούς θετικότητας πραγματοποιήθηκαν επίσης με επιτυχία (Εικ. 1).
Για να αποφευχθεί η εξάντληση του σπάνιου διαθέσιμου υλικού δειγματοληψίας, τα εναπομείναντα εξαγόμενα RNA παραδόθηκαν στο τοπικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (ένα από τα κλινικά κέντρα που είναι εξουσιοδοτημένα από την ιταλική κυβέρνηση για διαγνωστικές εξετάσεις SARS-CoV-2), προκειμένου να πραγματοποιηθεί μια δεύτερη παράλληλη τυφλή δοκιμή.Αυτό το δεύτερο κλινικό εργαστήριο εξέτασε 34 εκχυλίσεις RNA για τα γονίδια E, N και RdRP, αναφέροντας 7 θετικά αποτελέσματα για τουλάχιστον ένα από τα τρία γονίδια δεικτών, με θετικότητα επιβεβαιωμένη ξεχωριστά και για τους τρεις δείκτες (Εικ. 2).Λόγω της φύσης του δείγματος και λαμβάνοντας υπόψη ότι η δειγματοληψία δεν έχει πραγματοποιηθεί για κλινικούς διαγνωστικούς σκοπούς αλλά για δοκιμές περιβαλλοντικής ρύπανσης (λαμβάνοντας επίσης υπόψη ότι τα φίλτρα αποθηκεύτηκαν για τουλάχιστον τέσσερις εβδομάδες πριν υποβληθούν σε μοριακές γενετικές αναλύσεις, όπωςσυνέπεια του ιταλικού τερματισμού λειτουργίας), μπορούμε να επιβεβαιώσουμε ότι έχουμε αποδείξει εύλογα την παρουσία του ιικού RNA του SARS-CoV-2 ανιχνεύοντας εξαιρετικά συγκεκριμένο «γονίδιο RtDR» σε 8 φίλτρα.Ωστόσο, λόγω της έλλειψης πρόσθετων υλικών από τα φίλτρα, δεν μπορέσαμε να επαναλάβουμε αρκετό αριθμό δοκιμών για να δείξουμε θετικότητα και για τους 3 μοριακούς δείκτες ταυτόχρονα.
Αυτή είναι η πρώτη προκαταρκτική απόδειξη ότι το RNA SARS-CoV-2 μπορεί να υπάρχει σε υπαίθρια σωματίδια, υποδηλώνοντας έτσι ότι, σε συνθήκες ατμοσφαιρικής σταθερότητας και υψηλών συγκεντρώσεων PM, ο SARS-CoV-2 θα μπορούσε να δημιουργήσει συστάδες με υπαίθρια σωματίδια και - με μείωση του συντελεστή διάχυσής τους – ενισχύουν την επιμονή του ιού στην ατμόσφαιρα.Περαιτέρω επιβεβαιώσεις αυτής της προκαταρκτικήςΤα στοιχεία βρίσκονται σε εξέλιξη και θα πρέπει να περιλαμβάνουν αξιολόγηση σε πραγματικό χρόνο σχετικά με τη ζωτικότητα του SARS-CoV-2 καθώς και τη λοιμογόνο δράση του όταν προσροφάται σε σωματίδια.Προς το παρόν, δεν μπορούν να γίνουν υποθέσεις σχετικά με τη συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του ιού στο PM και της εξέλιξης της επιδημίας COVID-19.Άλλα ζητήματα που πρέπει να αντιμετωπιστούν συγκεκριμένα είναι οι μέσες συγκεντρώσεις PM τελικάαπαιτείται για ένα πιθανό «ενισχυτικό αποτέλεσμα» της μετάδοσης (σε περίπτωση που επιβεβαιωθεί ότι το PM μπορεί να λειτουργήσει ως «φορέας» για τους πυρήνες των ιικών σταγονιδίων), ή ακόμα και τη θεωρητική πιθανότητα ανοσοποίησης ως αποτέλεσμα εκθέσεων ελάχιστης δόσης σε χαμηλότερα κατώφλια PM .

Εικ.1 Καμπύλες ενίσχυσης των γονιδίων E (A) και RdRP (B): οι πράσινες γραμμές αντιπροσωπεύουν δοκιμασμένα φίλτρα.εγκάρσιες γραμμέςαντιπροσωπεύει εξαγωγές φίλτρων αναφοράς.Οι κόκκινες γραμμές αντιπροσωπεύουν την ενίσχυση των θετικών δειγμάτων.
Εικ.1

Εικ.2.Θετικά αποτελέσματα (σημειωμένα με Χ) για τα γονίδια E, N και RdRP που ελήφθησαν για όλα τα δείγματα 34 PM10φίλτρα που δοκιμάστηκαν στις δεύτερες παράλληλες αναλύσεις.
Εικ.2Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Prisco Milessi9,
1. Τμήμα Βιομηχανικής Χημείας, Πανεπιστήμιο της Μπολόνια, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Μπολόνια, Ιταλία
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Διατμηματικό Κέντρο Βιομηχανικών Ερευνών «Ανανεώσιμες Πηγές, Περιβάλλον, Γαλάζια Ανάπτυξη, Ενέργεια»,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο «Aldo Moro» του Μπάρι, Μπάρι, Ιταλία
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Τμήμα Χημικών και Φαρμακευτικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Τεργέστης, Τεργέστη, Ιταλία
e-mail: barbierp@units.it
5. Διεύθυνση Περιβαλλοντικής Έρευνας, TCR TECORA, Μιλάνο, Ιταλία
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Τμήμα Επιστημών Ζωής – Πανεπιστήμιο Τεργέστης, Τεργέστη, Ιταλία
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Division of Laboratory Medicine, University Hospital Giuliano Isontina (ASU GI), Τεργέστη, Ιταλία
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), Μιλάνο, Ιταλία
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Department of Environmental Science and Poicy, University of Milan, Milan, Italy
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Αντίστοιχος Συγγραφέας:
Λεονάρντο Σέττι, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it

βιβλιογραφικές αναφορές
1. Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας, Τρόποι μετάδοσης του ιού που προκαλεί COVID-19: επιπτώσεις για τις συστάσεις προφύλαξης IPC, Επιστημονική σύντομη.διαθέσιμο στη διεύθυνση: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 Μαρτίου 2020)
2. Υπουργείο Υγείας της Ιταλίας, καθημερινό δελτίο επιδημίας Covid-19 στην Ιταλία, διαθέσιμο στη διεύθυνση http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. ΕΟΠ, Ευρωπαϊκός Οργανισμός Περιβάλλοντος, Έκθεση για την ποιότητα του αέρα στην Ευρώπη 2019.No 10/2019;Ευρωπαϊκός Οργανισμός Περιβάλλοντος: Κοπεγχάγη, Δανία, διαθέσιμη στη διεύθυνση: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Έκθεση στην ατμοσφαιρική ρύπανση και θνησιμότητα από COVID-19 στις Ηνωμένες Πολιτείες, διαθέσιμη στη διεύθυνση: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), Position Paper Particulate Matter and COVID-19,
διαθέσιμο στη διεύθυνση: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A., Piscitelli P, Miani A., Is there a Plausible Role για τη σωματιδιακή ύλη στην εξάπλωση του COVID-19 στη Βόρεια Ιταλία;, BMJ Rapid Responses, 8 Απριλίου 2020, διαθέσιμη στη διεύθυνση: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generation of avian influenza virus (AIV) contamated fecal fine particulate particulate (PM2.5): ανίχνευση γονιδιώματος και μολυσματικότητας και υπολογισμός της εμφάνισης.Κτηνιατρική Μικροβιολογία.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Η αεροπορική μετάδοση μπορεί να έπαιξε ρόλο στην εξάπλωση των εξαιρετικά παθογονικών εστιών γρίπης των πτηνών το 2015 στην Ηνωμένες Πολιτείες.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Αξιολόγηση για τον αντίκτυπο των γεγονότων σκόνης στη συχνότητα εμφάνισης ιλαράς στη δυτική Κίνα.Ατμοσφαιρικό Περιβάλλον.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Ένα ολοκληρωμένο μοντέλο για την πρόβλεψη της ατμοσφαιρικής εξάπλωσης του ιού του αφθώδους πυρετού Epidemiol.Infect., 124, 577-590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. New Directions: Airborne Transmission of Foot-and-Mouth Disease Virus Atmospheric Environment, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Ρυθμοί εναπόθεσης ιών και βακτηρίων πάνω από το ατμοσφαιρικό οριακό στρώμα.Το περιοδικό ISME.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Διαχρονική έρευνα μικροβιώματος που σχετίζεται με σωματίδια σε μια μεγαλούπολη.Βιολογία Γονιδιώματος.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Η Airborne μετάδοση μπορεί να έχει
έπαιξε ρόλο στην εξάπλωση των επιδημιών γρίπης των πτηνών υψηλής παθογονικότητας το 2015 στις Ηνωμένες Πολιτείες.Sci
Απ. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Αξιολόγηση για τον αντίκτυπο των γεγονότων σκόνης στη συχνότητα εμφάνισης ιλαράς στη δυτική Κίνα.Ατμοσφαιρικό Περιβάλλον.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, ​​G., Jiang, J., Zhu, TF Βελτιστοποιημένη εξαγωγή DNA και μεταγονιδιωματικός προσδιορισμός αλληλουχίας αερομεταφερόμενων μικροβιακών κοινοτήτων .Nat.Πρωτοκ.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Collection, particle sizing and detection of airborne viruses.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, περιγραφή προϊόντος, διαθέσιμη στη διεύθυνση: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, περιγραφή του προϊόντος, διαθέσιμη στη διεύθυνση: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, ​​R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Ανίχνευση του νέου κοροναϊού 2019 (2019-nCoV) με RT-PCR σε πραγματικό χρόνο.Eurosurveillance, 25(3), διαθέσιμο στη διεύθυνση:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/

Πρωτότυπο: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995


Ώρα δημοσίευσης: Απρ-18-2020