Признато е, че тежкият остър респираторен синдром, известен като заболяване на COVID-19 – дължащ се на вируса SARS-CoV-2, се разпространява чрез респираторни капчици и близки контакти.[1]Тежестта на COVID-19 беше изключително тежка в Ломбардия и долината По (Северна Италия),[2] област, характеризираща се с високи концентрации на прахови частици, за които вече е известно, че оказват отрицателно въздействие върху човешкото здраве.[3]Наличните регионални данни за Италия към датата 12 април показват, че около 30% от понастоящем позитивните хора все още живеят в Ломбардия (около 40%, ако се вземат предвид общите случаи, потвърдени от началото на епидемията), следвана от Емилия Романя (13,5%) , Пиемонт (10,5%) и Венето (10%).[2]Тези четири региона на долината на река По представляват 80% от общите смъртни случаи, регистрирани в Италия, и 65% от приема на интензивни отделения.[2]
Изследване, проведено от Харвардското училище по обществено здраве, изглежда потвърждава връзката между увеличенията на концентрациите на ФПЧ и нивата на смъртност поради COVID-19 в САЩ[4]. В предишни съобщения ние предположихме възможността SARS-CoV-2 вирусът може да присъства върху прахови частици (PM) по време на разпространението на инфекцията, [5,6] в съответствие с вече доказателство
наличен за други вируси.[7-15] Въпреки това, въпросът за микробиома, свързан с PM във въздуха, особено в градска среда, остава до голяма степен недостатъчно проучен [16] и – към момента – никой все още не е извършил експериментални проучвания, специално насочени при потвърждаване или изключване на наличието на SARS-CoV-2 на PM.
Тук представяме първите резултати от анализите, които сме извършили върху 34 проби PM10 от външни/въздушни PM10 от промишлен обект в провинция Бергамо, събрани с два различни апарата за вземане на проби за въздух в продължение на непрекъснат период от 3 седмици, от 21 февруари до март 13-ти.
Следвайки методологията, описана от Pan et al.през 2019 г. (за събиране, определяне на размера на частиците и откриване на вируси, пренасяни по въздуха),[17] пробите от прахови частици бяха събрани върху филтри от кварцови влакна с помощта на гравиметричен въздушен пробоотборник с малък обем (38,3 l/min за 23 часа), в съответствие с референтния метод EN12341 :2014 за мониторинг на PM10.Праховите частици бяха уловени върху филтри с 99,9% типичноаерозолно задържане, правилно съхранявани и доставени в лабораторията по приложна и сравнителна геномика на университета в Триест.Като се има предвид "екологичният" характер на пробата, вероятно богата на инхибитори на ДНК полимерази, ние продължихме с екстракцията на РНК с помощта на комплекта Quick RNA за фекални почвени микроби, адаптиран към типа на филтрите.[18]Половин филтърът беше навит с горната страна навътре,в полипропиленова туба от 5 ml, заедно с перлите, предоставени в комплекта.От първоначалния 1 ml лизиращ буфер успяхме да получим около 400 ul разтвор, който след това беше обработен, както е определено от стандартните протоколи, което води до краен елуат от 15 ul.Впоследствие 5 ul бяха използвани за тестване на SARS-CoV-2.Като се има предвид специфичният произход на пробата, беше използван qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Системите за усилване бяха тези на протокола, разработен от Corman et al, публикуван на уебсайта на СЗО [20].
Тестът беше изрично насочен към потвърждаване или изключване на наличието на РНК на SARS-CoV-2 върху прахови частици.Първият анализ използва "Е гена" като молекулярен маркер и даде впечатляващ положителен резултат при 15 от 16 филтъра, дори ако, както можехме да очакваме, Ct беше между 36-38 цикъла.
След това повторихме анализа на 6 от положителните филтри (вече положителни за „Е ген“), като използвахме „RtDR гена“ като молекулярен маркер – който е силно специфичен за SARS-CoV-2 – достигайки 5 значими резултата на позитивността;успешно бяха извършени и контролни тестове за изключване на фалшива положителност (фиг. 1).
За да се избегне изчерпването на наличния оскъдният материал за вземане на проби, останалите извлечени РНК бяха доставени в местната университетска болница (един от клиничните центрове, упълномощени от италианското правителство за диагностични тестове за SARS-CoV-2), за да се извърши втори паралелен сляп тест.Тази втора клинична лаборатория тества 34 екстракции на РНК за гените E, N и RdRP, отчитайки 7 положителни резултата за поне един от трите маркерни гена, като положителността е потвърдена отделно за всичките три маркера (фиг. 2).Поради естеството на пробата и като се има предвид, че вземането на проби не е извършено за клинични диагностични цели, а за тестове за замърсяване на околната среда (като се има предвид също, че филтрите са били съхранявани най-малко четири седмици преди да бъдат подложени на молекулярно-генетични анализи, т.к.следствие от затварянето на Италия), можем да потвърдим, че разумно сме показали наличието на вирусна РНК на SARS-CoV-2 чрез откриване на силно специфичен „RtDR ген“ на 8 филтъра.Въпреки това, поради липсата на допълнителни материали от филтрите, не успяхме да повторим достатъчен брой тестове, за да покажем положителност за всичките 3 молекулни маркера едновременно.
Това е първото предварително доказателство, че SARS-CoV-2 РНК може да присъства върху прахови частици на открито, което предполага, че в условия на атмосферна стабилност и високи концентрации на ФПЧ, SARS-CoV-2 може да създаде клъстери с ФПЧ на открито и – чрез намаляване на техния коефициент на дифузия – засилване на устойчивостта на вируса в атмосферата.Допълнителни потвърждения на това предварителнодоказателствата продължават и трябва да включват оценка в реално време за жизнеността на SARS-CoV-2, както и за неговата вирулентност, когато се адсорбира върху прахови частици.Понастоящем не могат да се правят предположения относно връзката между наличието на вируса върху PM и прогресирането на огнището на COVID-19.Други въпроси, на които трябва да се обърне специално внимание, са евентуалните средни концентрации на ФПЧнеобходим за потенциален „усилващ ефект“ на заразата (в случай че се потвърди, че PM може да действа като „носител“ за ядрата на вирусните капчици), или дори теоретичната възможност за имунизация в резултат на експозиция на минимална доза при по-ниски прагове на PM .
Фиг.1 Криви на амплификация на E (A) и RdRP гени (B): зелените линии представляват тествани филтри;кръстосани линиипредставлява референтни филтърни екстракции;червените линии представляват усилването на положителните проби.
Фиг.2.Положителни резултати (маркирани с X) за E, N и RdRP гени, получени за всички 34 проби PM10филтри, тествани във втория паралелен анализ.
Леонардо Сети1, Фабрицио Пасарини2, Джанлуиджи Де Дженаро3, Пиерлуиджи Барбиери4, Мария Грация Пероне5, Масимо Борели6, Йоланда Палмизани3, Алесия Ди Джилио3, Валентина Торболи6, Алберто Палавичини6, Маурицио Русио7, Приско Писчители8, Алесандро Миани8,9
1. Катедра Индустриална химия, Университет на Болоня, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Болоня, Италия
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Междуведомствен център за индустриални изследвания „Възобновяеми източници, околна среда, син растеж, енергия”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Катедра по биология, Университет „Алдо Моро” в Бари, Бари, Италия
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Катедра по химични и фармацевтични науки, Университет на Триест, Триест, Италия
e-mail: barbierp@units.it
5. Отдел за изследване на околната среда, TCR TECORA, Милано, Италия
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Департамент по природни науки – Университет на Триест, Триест, Италия
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Отдел по лабораторна медицина, Университетска болница Giuliano Isontina (ASU GI), Триест, Италия
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Италианско дружество по екологична медицина (SIMA), Милано, Италия
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Катедра по екологични науки и политика, Университет на Милано, Милано, Италия
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Автора за кореспонденция:
Леонардо Сети, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Препратки
1. Световна здравна организация, Начини на предаване на вируса, причиняващ COVID-19: последици за препоръките за IPC предпазни мерки, Научна справка;достъпно на: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 март 2020 г.)
2. Италианското министерство на здравеопазването, ежедневен бюлетин за епидемията от Covid-19 в Италия, достъпен на http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. ЕАОС, Европейска агенция по околна среда, Доклад за качеството на въздуха в Европа за 2019 г.;№ 10/2019 г.;Европейска агенция по околна среда: Копенхаген, Дания, достъпна на: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Излагане на замърсяване на въздуха и смъртност от COVID-19 в Съединените щати, достъпно на: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Италианско дружество по екологична медицина (SIMA), Позиционен документ Прахови частици и COVID-19,
достъпно на: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Има ли правдоподобна роля за прахови частици при разпространението на COVID-19 в Северна Италия?, BMJ Rapid Responses, 8 април 2020 г., достъпно на: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Генериране на фини прахови частици (PM2.5), замърсени с вируса на птичия грип (AIV): откриване на геном и инфекциозност и изчисляване на имисия.Ветеринарна микробиология.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Въздушно-капковото предаване може да е изиграло роля в разпространението на огнища на високопатогенна инфлуенца по птиците през 2015 г. Съединени щати.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Оценка за въздействието на праховите събития върху заболеваемостта от морбили в западен Китай.Атмосферна среда.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Интегриран модел за прогнозиране на атмосферното разпространение на вируса на болестта шап Epidemiol.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Нови насоки: Въздушно-капково предаване на вируса на шап атмосферна среда, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Младенов, N., Winget, DM, Suttle, CA Скорости на отлагане на вируси и бактерии над граничния слой на атмосферата.Журналът на ISME.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Надлъжно изследване на микробиома, свързан с прахови частици в мегаполис.Биология на генома.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Въздушното предаване може да има
изиграха роля в разпространението на огнища на високопатогенна инфлуенца по птиците през 2015 г. в Съединените щати.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Оценка за въздействието на праховите събития върху заболеваемостта от морбили в западен Китай.Атмосферна среда.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Оптимизирана екстракция на ДНК и метагеномно секвениране на микробни общности във въздуха .Нац.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Събиране, оразмеряване на частици и откриване на вируси, пренасяни по въздуха.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, описание на продукта, достъпно на: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, описание на продукта, достъпно на: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Откриване на нов коронавирус 2019 (2019-nCoV) чрез RT-PCR в реално време.Eurosurveillance, 25 (3), достъпен на: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Оригинал: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Време за публикуване: 18 април 2020 г