Встановлено, що важкий гострий респіраторний синдром, відомий як хвороба COVID-19, через вірус SARS-CoV-2, поширюється повітряно-крапельним шляхом і через тісні контакти.[1]Тягар COVID-19 був надзвичайно важким у Ломбардії та долині По (Північна Італія),[2] регіоні, що характеризується високими концентраціями твердих частинок, які, як уже відомо, негативно впливають на здоров’я людини[3].Регіональні дані, доступні для Італії станом на 12 квітня, показують, що близько 30% наразі позитивних людей все ще живуть у Ломбардії (близько 40%, якщо врахувати загальну кількість підтверджених випадків з початку епідемії), за якою йде Емілія-Романья (13,5%). , П’ємонт (10,5%) і Венето (10%).[2]На ці чотири регіони долини По припадає 80% усіх смертей, зареєстрованих в Італії, і 65% госпіталізацій у відділеннях інтенсивної терапії [2].
Дослідження, проведене Гарвардською школою громадської охорони здоров’я, здається, підтверджує зв’язок між підвищенням концентрації твердих частинок і рівнем смертності внаслідок COVID-19 у США [4]. У попередніх повідомленнях ми висунули гіпотезу про можливість SARS-CoV-2 вірус міг бути присутнім на твердих частинках (PM) під час поширення інфекції [5,6] відповідно до вже наявних доказів
доступні для інших вірусів.[7-15] Проте питання мікробіома, пов'язаного з повітряними ТЧ, особливо в міських умовах, залишається значною мірою недостатньо дослідженим [16], і на даний момент ніхто досі не проводив експериментальних досліджень, спеціально спрямованих на при підтвердженні або виключенні наявності SARS-CoV-2 на ПМ.
Тут ми представляємо перші результати аналізу, який ми виконали на 34 пробах PM10 PM10 на відкритому повітрі/в повітрі з промислової території провінції Бергамо, зібраних двома різними пробовідбірниками повітря протягом безперервного 3-тижневого періоду, з 21 лютого по березень. 13-й.
Дотримуючись методології, описаної Pan et al.у 2019 році (для збору, визначення розміру частинок і виявлення повітряно-крапельних вірусів) [17] зразки PM були зібрані на кварцово-волокнистих фільтрах за допомогою гравіметричного пробовідбірника повітря низького об’єму (38,3 л/хв протягом 23 годин), що відповідає еталонному методу EN12341 :2014 для моніторингу PM10.Тверді частки були уловлені на фільтрах із типовим показником 99,9%.утримання аерозолів, належним чином зберігати та доставляти до лабораторії прикладної та порівняльної геноміки Університету Трієста.Враховуючи «екологічний» характер зразка, імовірно багатого інгібіторами ДНК-полімераз, ми продовжили екстракцію РНК за допомогою мікробного набору Quick RNA fecal soil microbe, адаптованого до типу фільтрів.[18]Половину фільтра згорнули верхньою стороною всередину,у поліпропіленовій пробірці об’ємом 5 мл разом із кульками, що входять до комплекту.З початкового 1 мл буфера для лізису ми змогли отримати приблизно 400 мкл розчину, який потім обробляли, як визначено стандартними протоколами, в результаті чого кінцевий елюат становив 15 мкл.Згодом 5 мкл було використано для тестування на SARS-CoV-2.Враховуючи особливе походження зразка, було використано qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Системи ампліфікації відповідали протоколу, розробленому Корманом та ін., опублікованому на веб-сайті ВООЗ [20].
Тест був явно спрямований на підтвердження або виключення присутності РНК SARS-CoV-2 у твердих частинках.Перший аналіз використовував «ген E» як молекулярний маркер і дав вражаючий позитивний результат на 15 із 16 фільтрів, навіть якщо, як ми могли очікувати, Ct становив 36-38 циклів.
Після цього ми повторили аналіз на 6 позитивних фільтрах (вже позитивних на «ген E»), використовуючи «ген RtDR» як молекулярний маркер, який є високоспецифічним для SARS-CoV-2, і отримали 5 значущих результатів. позитиву;також були успішно проведені контрольні тести для виключення хибнопозитивних результатів (рис. 1).
Щоб уникнути вичерпання дефіцитного матеріалу для зразків, решту екстрагованих РНК було доставлено до місцевої університетської лікарні (один із клінічних центрів, уповноважених урядом Італії проводити діагностичні тести на SARS-CoV-2), щоб виконати другий паралельний сліпий тест.Ця друга клінічна лабораторія протестувала 34 екстракції РНК для генів E, N і RdRP, повідомляючи про 7 позитивних результатів принаймні для одного з трьох маркерних генів, з окремо підтвердженою позитивністю для всіх трьох маркерів (рис. 2).Через характер зразка та з огляду на те, що відбір проб проводився не для клінічних діагностичних цілей, а для тестів на забруднення навколишнього середовища (беручи також до уваги, що фільтри зберігалися принаймні чотири тижні перед проходженням молекулярно-генетичного аналізу, оскількинаслідок припинення роботи в Італії), ми можемо підтвердити, що обґрунтовано продемонстрували наявність РНК вірусу SARS-CoV-2, виявивши високоспецифічний «ген RtDR» на 8 фільтрах.Однак через відсутність додаткових матеріалів із фільтрів ми не змогли повторити достатню кількість тестів, щоб показати позитивність для всіх 3 молекулярних маркерів одночасно.
Це перший попередній доказ того, що РНК SARS-CoV-2 може бути присутнім у твердих частинках на відкритому повітрі, таким чином припускаючи, що в умовах стабільної атмосфери та високих концентрацій ТЧ SARS-CoV-2 може створювати кластери з ТЧ на відкритому повітрі та – шляхом зниження їх коефіцієнта дифузії – посилення стійкості вірусу в атмосфері.Подальші підтвердження цього попередньогодокази тривають і повинні включати оцінку в режимі реального часу життєздатності SARS-CoV-2, а також його вірулентності при адсорбції на твердих частинках.Наразі неможливо зробити жодних припущень щодо кореляції між наявністю вірусу на ПМ та прогресуванням спалаху COVID-19.Інші питання, на які слід звернути особливу увагу, це кінцеві середні концентрації ТЧнеобхідний для потенційного «підсилювального ефекту» зараження (якщо буде підтверджено, що ТЧ можуть діяти як «переносники» для ядер вірусних крапель), або навіть теоретична можливість імунізації внаслідок впливу мінімальної дози при нижчих порогових значеннях ТЧ .
Рис.1 Криві ампліфікації генів E (A) і RdRP (B): зелені лінії представляють перевірені фільтри;перехресні лініїпредставляє еталонні фільтри вилучення;червоні лінії представляють посилення позитивних зразків.
Рис.2.Позитивні результати (позначені X) для генів E, N і RdRP отримані для всіх 34 зразків PM10фільтри, перевірені в другому паралельному аналізі.
Леонардо Сетті1, Фабріціо Пассаріні2, Джанлуїджі Де Дженнаро3, П'єрлуїджі Барб'єрі4, Марія Грація Перроне5, Массімо Бореллі6, Йоланда Палмізані3, Алессія Ді Джіліо3, Валентина Торболі6, Альберто Паллавічіні6, Мауріціо Русіо7, Пріско Пісцітеллі8, Алессандро Міані8,9
1. Факультет промислової хімії, Болонський університет, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Болонья, Італія
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Міжвідомчий центр промислових досліджень «Відновлювані джерела, довкілля, блакитне зростання, енергетика»,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Кафедра біології, Університет «Альдо Моро» Барі, Барі, Італія
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Кафедра хіміко-фармацевтичних наук, Університет Трієста, Трієст, Італія
e-mail: barbierp@units.it
5. Відділ екологічних досліджень, TCR TECORA, Мілан, Італія
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Факультет природничих наук – Університет Трієста, Трієст, Італія
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Відділення лабораторної медицини, Університетська лікарня Джуліано Ізонтіна (ASU GI), Трієст, Італія
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Італійське товариство екологічної медицини (SIMA), Мілан, Італія
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Департамент екологічних наук і політики Міланського університету, Мілан, Італія
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Відповідний автор:
Леонардо Сетті, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Список літератури
1. Всесвітня організація охорони здоров’я, Шляхи передачі вірусу, що спричиняє COVID-19: наслідки для рекомендацій IPC щодо запобіжних заходів, Науковий огляд;доступно за адресою: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 березня 2020 р.)
2. Міністерство охорони здоров’я Італії, щоденний бюлетень про спалах Covid-19 в Італії, доступний за адресою http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Європейське агентство з навколишнього середовища, Звіт про якість повітря в Європі за 2019 рік;№ 10/2019;Європейське агентство з навколишнього середовища: Копенгаген, Данія, доступно за адресою: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Exposure to air pollution and COVID-19 mortality in the United States, доступно за адресою: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Італійське товариство екологічної медицини (SIMA), Позиційний документ щодо твердих частинок і COVID-19,
доступно за адресою: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Сетті Л., Пассаріні Ф., Де Дженнаро Г., Барб'єрі П., Перроне М.Г., П'яцалунга А., Бореллі М., Палмізані Дж., Ді Джіліо А, Пісцітеллі П, Міані А., Чи є вірогідна роль для твердих частинок у поширенні COVID-19 у Північній Італії?, BMJ Rapid Responses, 8 квітня 2020 р., доступно за адресою: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Генерація фекальних дрібних твердих частинок (PM2,5), заражених вірусом пташиного грипу (AIV): виявлення геному та інфекційності та розрахунок імісії.Ветеринарна мікробіологія.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Повітряно-крапельна передача могла зіграти роль у поширенні спалахів високопатогенного пташиного грипу в 2015 році. Сполучені Штати.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Оцінка впливу пилових явищ на захворюваність на кір у західному Китаї.Атмосферне середовище.157, 1-9 (2017)
10. Соренсен, Дж. Х., Маккей, Д. К. Дж., Дженсен, К. О., Дональдсон, А. І. Інтегрована модель для прогнозування атмосферного поширення вірусу ящуру Epidemiol.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. New Directions: Airborne Transmission of Foot-and-Mouth Disease Virus Atmospheric Environment, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Швидкість осадження вірусів і бактерій над атмосферним прикордонним шаром.Журнал ISME.12, 1154-1162 (2018)
13. Цинь Н., Лян П., Ву К., Ван Г., Сюй К., Сюн X., Ван Т., Зольфо М., Сегата Н., Цінь Х. ., Найт, Р., Гілберт, Дж.А., Чжу, Т.Ф. Поздовжнє дослідження мікробіому, пов’язаного з твердими частинками в мегаполісі.Біологія геному.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Повітряно-крапельна передача може мати
зіграли роль у поширенні спалахів високопатогенного пташиного грипу в Сполучених Штатах у 2015 році.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Оцінка впливу пилових подій на захворюваність на кір у західному Китаї.Атмосферне середовище.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Оптимізована екстракція ДНК і метагеномне секвенування повітряних мікробних спільнот .Нац.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Пан М., Ледніцкі Дж.А., Ву К.-Й. Збір, визначення розміру частинок і виявлення вірусів, що передаються повітряно-крапельним шляхом.Журнал прикладної мікробіології, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, опис продукту, доступний за адресою: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, опис продукту, доступний за адресою: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Корман, В. М., Ландт, О., Кайзер, М., Моленкамп, Р., Мейер, А., Чу, ДК, і Малдерс, Д. Г. (2020).
Виявлення нового коронавірусу 2019 (2019-nCoV) за допомогою RT-PCR в реальному часі.Eurosurveillance, 25(3), доступно за адресою: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Оригінал: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Час публікації: 18 квітня 2020 р