Svårt akut respiratoriskt syndrom, känt som COVID-19-sjukdomen – på grund av SARS-CoV-2-virus – är känt för att spridas via luftvägsdroppar och nära kontakter.[1]Belastningen av covid-19 var extremt allvarlig i Lombardiet och Po-dalen (Norra Italien),[2] ett område som kännetecknas av höga koncentrationer av partiklar, som redan är kända för att ha negativa effekter på människors hälsa.[3]Regionala siffror tillgängliga för Italien den 12 april visar att cirka 30 % av de för närvarande positiva människorna fortfarande bor i Lombardiet (cirka 40 % om man tar hänsyn till de totala fall som bekräftats från epidemins början), följt av Emilia Romagna (13,5 %) , Piemonte (10,5%) och Veneto (10%).[2]Dessa fyra regioner i Po-dalen står för 80 % av de totala dödsfallen registrerade i Italien och 65 % av inläggningarna på intensivvårdsavdelningar.[2]
En forskning utförd av Harvard School of Public Health verkar bekräfta ett samband mellan ökningar av PM-koncentrationer och dödlighet på grund av covid-19 i USA[4] I tidigare meddelanden har vi antagit möjligheten att SARS-CoV-2 virus kan förekomma på partiklar (PM) under spridningen av infektionen,[5,6] i överensstämmelse med bevis som redan finns
tillgängliga för andra virus.[7-15] Emellertid är frågan om luftburen PM-associerad mikrobiom, särskilt i stadsmiljöer, fortfarande till stor del undersökt,[16] och – för närvarande – har ingen fortfarande utfört experimentella studier specifikt inriktade på vid bekräfta eller utesluta närvaron av SARS-CoV-2 på PM.
Här presenterar vi de första resultaten av de analyser som vi har utfört på 34 PM10-prover av utomhus/luftburen PM10 från en industrianläggning i Bergamoprovinsen, insamlade med två olika luftprovtagare under en sammanhängande 3-veckorsperiod, från 21 februari till mars 13:e.
Genom att följa den metod som beskrivs av Pan et al.under 2019 (för insamling, partikelstorlek och detektion av luftburna virus)[17] samlades PM-prover på kvartsfiberfilter med hjälp av en gravimetrisk luftprovtagare med låg volym (38,3 l/min under 23 timmar), i enlighet med referensmetoden EN12341 :2014 för PM10-övervakning.Partiklar fångades på filter med 99,9% typisktaerosolretention, korrekt lagrad och levererad till laboratoriet för tillämpad och jämförande genomik vid Trieste University.Med tanke på den "miljömässiga" naturen hos provet, förmodligen rikt på hämmare av DNA-polymeraser, fortsatte vi med extraktion av RNA genom att använda Quick RNA fekal jordmikrobe kit anpassat till typen av filter.[18]Halvfiltret rullades, med ovansidan vänd inåt,i ett 5 ml polypropenrör, tillsammans med pärlorna som ingår i satsen.Från den initiala 1 ml lysisbuffert kunde vi få cirka 400 ul lösning, som sedan bearbetades enligt definitionen av standardprotokollen, vilket resulterade i ett slutligt eluat på 15 ul.Därefter användes 5 ul för SARS-CoV-2-testning.Med tanke på provets speciella ursprung användes qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Amplifieringssystemen var de i protokollet utvecklat av Corman et al, publicerat på WHO:s webbplats [20].
Testet syftade uttryckligen till att bekräfta eller utesluta närvaron av SARS-CoV-2 RNA på partiklar.Den första analysen använde "E-genen" som en molekylär markör och gav ett imponerande positivt resultat på 15 av 16 filter även om, som vi kunde förvänta oss, Ct var mellan 36-38 cykler.
Efter det har vi replikerat analysen på 6 av de positiva filtren (redan positiva till "E-genen") genom att använda "RtDR-genen" som en molekylär markör - som är mycket specifik för SARS-CoV-2 - och nådde 5 signifikanta resultat av positivitet;kontrolltester för att utesluta falsk positivitet utfördes också framgångsrikt (Fig. 1).
För att undvika att ta slut på det knappa provtagningsmaterialet som finns tillgängligt levererades de återstående extraherade RNA:erna till det lokala universitetssjukhuset (ett av de kliniska centra som godkänts av den italienska regeringen för SARS-CoV-2 diagnostiska tester), för att utföra en andra parallellt blindtest.Detta andra kliniska laboratorium testade 34 RNA-extraktioner för E-, N- och RdRP-generna och rapporterade 7 positiva resultat för minst en av de tre markörgenerna, med positivitet separat bekräftad för alla de tre markörerna (Fig. 2).På grund av provets natur och med tanke på att provtagningen inte har utförts i kliniska diagnostiska syften utan för miljöföroreningstester (med hänsyn också till att filter lagrades i minst fyra veckor innan de genomgick molekylärgenetiska analyser, somen konsekvens av den italienska nedläggningen), kan vi bekräfta att vi rimligen har visat närvaron av SARS-CoV-2 viralt RNA genom att detektera mycket specifik "RtDR-gen" på 8 filter.Men på grund av bristen på ytterligare material från filtren kunde vi inte upprepa tillräckligt många tester för att visa positivitet för alla de 3 molekylära markörerna samtidigt.
Detta är det första preliminära beviset på att SARS-CoV-2 RNA kan finnas på partiklar utomhus, vilket tyder på att SARS-CoV-2 under förhållanden med atmosfärisk stabilitet och höga koncentrationer av PM kan skapa kluster med utomhus PM och – genom minskar deras diffusionskoefficient – förbättrar virusets persistens i atmosfären.Ytterligare bekräftelser av denna preliminärabevis pågår och bör inkludera realtidsbedömning av SARS-CoV-2s vitalitet samt dess virulens när det adsorberas på partiklar.För närvarande kan inga antaganden göras om sambandet mellan förekomsten av viruset på PM och utvecklingen av covid-19-utbrottet.Andra frågor som ska behandlas specifikt är de genomsnittliga koncentrationerna av partiklar så småningomkrävs för en potentiell "boost-effekt" av smittan (om det bekräftas att PM kan fungera som en "bärare" för de virala droppkärnorna), eller till och med den teoretiska möjligheten till immunisering till följd av minimal dosexponering vid lägre tröskelvärden för PM .
Fig. 1 Amplifieringskurvor för E (A) och RdRP gener (B): gröna linjer representerar testade filter;korsa linjerrepresenterar referensfilterextraktioner;röda linjer representerar amplifieringen av de positiva proverna.
Fig.2.Positiva resultat (markerade med X) för E-, N- och RdRP-gener erhållna för alla 34 PM10-proverfilter som testades i de andra parallella analyserna.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, A9andro
1. Institutionen för industriell kemi, Bolognas universitet, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italien
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Interdepartementalt centrum för industriell forskning "Förnybara källor, miljö, blå tillväxt, energi",
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Biologiska institutionen, universitetet "Aldo Moro" i Bari, Bari, Italien
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Institutionen för kemi och farmaceutisk vetenskap, Triestes universitet, Trieste, Italien
e-mail: barbierp@units.it
5. Miljöforskningsavdelningen, TCR TECORA, Milano, Italien
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Institutionen för livsvetenskaper – Triestes universitet, Trieste, Italien
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Avdelningen för laboratoriemedicin, Universitetssjukhuset Giuliano Isontina (ASU GI), Trieste, Italien
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), Milano, Italien
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Institutionen för miljövetenskap och poicy, University of Milano, Milano, Italien
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Motsvarande författare:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Referenser
1. Världshälsoorganisationen, överföringssätt av virus som orsakar covid-19: konsekvenser för IPC:s försiktighetsrekommendationer, vetenskaplig översikt;tillgänglig på: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 mars 2020)
2. Italienska hälsoministeriet, daglig bulletin Covid-19-utbrott i Italien, tillgänglig på http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, European Environmental Agency, Air Quality in Europe 2019-rapport;nr 10/2019;Europeiska miljöbyrån: Köpenhamn, Danmark, tillgänglig på: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Exposure to air pollution and COVID-19 mortality in the United States, tillgänglig på: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), Position Paper Particulate Matter och COVID-19,
tillgänglig på: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Finns det en rimlig roll för partiklar i spridningen av covid-19 i norra Italien?, BMJ Rapid Responses, 8 april 2020, tillgänglig på: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generering av aviärt influensavirus (AIV) kontaminerade fekala fina partiklar (PM2.5): genom och smittsamhet detektion och beräkning av immission.Veterinär mikrobiologi.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Luftburen överföring kan ha spelat en roll i spridningen av 2015 års högpatogena aviär influensautbrott i Förenta staterna.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Bedömning för inverkan av dammhändelser på incidensen av mässling i västra Kina.Atmosfärisk miljö.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI En integrerad modell för att förutsäga den atmosfäriska spridningen av mul- och klövsjukevirus Epidemiol.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Nya riktningar: Luftburen överföring av mul- och klövsjukavirus Atmospheric Environment, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Avsättningshastigheter av virus och bakterier ovanför atmosfärens gränsskikt.ISME Journal.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H. ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Longitudinell undersökning av mikrobiom associerad med partiklar i en megastad.Genombiologi.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Luftburen transmission kan ha
spelade en roll i spridningen av 2015 års högpatogena aviär influensautbrott i USA.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Bedömning för inverkan av dammhändelser på incidensen av mässling i västra Kina.Atmosfärisk miljö.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Optimerad DNA-extraktion och metagenomisk sekvensering av luftburna mikrobiella samhällen .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Insamling, partikelstorlek och detektion av luftburna virus.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, produktbeskrivning, tillgänglig på: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, beskrivning av produkten, tillgänglig på: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Detektering av 2019 års nya coronavirus (2019-nCoV) genom RT-PCR i realtid.Eurosurveillance, 25(3), tillgänglig på:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Original: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Posttid: 18 april 2020