Znano je, da se hudi akutni respiratorni sindrom, znan kot bolezen COVID-19 – zaradi virusa SARS-CoV-2 – širi prek kapljic pri vdihavanju in tesnih stikih.[1]Breme COVID-19 je bilo izjemno hudo v Lombardiji in Padski nižini (severna Italija), [2] območju, za katerega so značilne visoke koncentracije trdnih delcev, za katere je že znano, da negativno vplivajo na zdravje ljudi.[3]Regionalni podatki, ki so na voljo za Italijo na dan 12. aprila, kažejo, da približno 30 % trenutno pozitivnih ljudi še vedno živi v Lombardiji (približno 40 %, če upoštevamo skupno število potrjenih primerov od začetka epidemije), sledi Emilia Romagna (13,5 %). , Piemont (10,5 %) in Veneto (10 %).[2]Te štiri regije Padske nižine predstavljajo 80 % vseh smrti, zabeleženih v Italiji, in 65 % sprejemov na enote intenzivne nege.[2]
Zdi se, da raziskava, ki jo je izvedla Harvard School of Public Health, potrjuje povezavo med povečanjem koncentracij PM in stopnjami umrljivosti zaradi COVID-19 v ZDA[4]. V prejšnjih sporočilih smo domnevali možnost, da SARS-CoV-2 virus je lahko prisoten na trdnih delcih (PM) med širjenjem okužbe [5,6], kar je skladno z že dokazanimi dokazi.
na voljo za druge viruse.[7-15] Vendar je vprašanje mikrobioma, povezanega s PM v zraku, zlasti v urbanih okoljih, še vedno v veliki meri premalo raziskano, [16] in – trenutno – še nihče ni izvedel eksperimentalnih študij, posebej namenjenih pri potrditvi ali izključitvi prisotnosti SARS-CoV-2 na PM.
Tukaj predstavljamo prve rezultate analiz, ki smo jih opravili na 34 vzorcih delcev PM10 zunanjih/v zraku delcev PM10 iz industrijske lokacije v provinci Bergamo, zbranih z dvema različnima vzorčevalnikoma zraka v neprekinjenem 3-tedenskem obdobju, od 21. februarja do marca. 13.
Po metodologiji, ki so jo opisali Pan et al.leta 2019 (za zbiranje, določanje velikosti delcev in odkrivanje virusov v zraku) [17] so bili vzorci delcev zbrani na filtrih iz kremenčevih vlaken z uporabo nizkovolumenskega gravimetričnega vzorčevalnika zraka (38,3 l/min za 23 ur), ki je skladen z referenčno metodo EN12341. :2014 za spremljanje delcev PM10.Trdni delci so bili ujeti na filtrih z 99,9 % tipičnoaerosolnega zadrževalnika, pravilno skladiščili in dostavili v laboratorij za uporabno in primerjalno genomiko Univerze v Trstu.Glede na »okoljsko« naravo vzorca, domnevno bogatega z inhibitorji DNA polimeraz, smo nadaljevali z ekstrakcijo RNA z uporabo kompleta mikrobov Quick RNA fecal soil, prilagojenega tipu filtrov.[18]Polovica filtra je bila zvita z zgornjo stranjo navznoter,v 5 ml polipropilenski tubi skupaj s perlicami, ki so priložene kompletu.Iz začetnega 1 ml liznega pufra smo lahko dobili približno 400 ul raztopine, ki je bila nato obdelana, kot je določeno s standardnimi protokoli, kar je povzročilo končni eluat 15 ul.Nato je bilo 5 ul uporabljenih za testiranje SARS-CoV-2.Glede na poseben izvor vzorca je bil uporabljen qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Sistemi za pomnoževanje so bili tisti iz protokola, ki so ga razvili Corman et al in so bili objavljeni na spletni strani WHO [20].
Test je bil izrecno namenjen potrditvi ali izključitvi prisotnosti RNK SARS-CoV-2 na trdnih delcih.Prva analiza je uporabila "gen E" kot molekularni marker in dala impresiven pozitiven rezultat na 15 od 16 filtrov, tudi če je bil Ct, kot bi lahko pričakovali, med 36-38 cikli.
Po tem smo ponovili analizo na 6 pozitivnih filtrih (že pozitivnih na »gen E«) z uporabo »gena RtDR« kot molekularnega označevalca – ki je zelo specifičen za SARS-CoV-2 – in dosegli 5 pomembnih rezultatov pozitivnosti;Uspešno so bili opravljeni tudi kontrolni testi za izključitev lažno pozitivnih rezultatov (slika 1).
Da bi preprečili, da bi zmanjkalo malo razpoložljivega materiala za vzorčenje, so bile preostale ekstrahirane RNA dostavljene v lokalno univerzitetno bolnišnico (enega od kliničnih centrov, ki jih je italijanska vlada pooblastila za diagnostične teste SARS-CoV-2), da bi izvedli drugi vzporedni slepi test.Ta drugi klinični laboratorij je testiral 34 ekstrakcij RNA za gene E, N in RdRP, pri čemer je poročal o 7 pozitivnih rezultatih za vsaj enega od treh markerskih genov, pri čemer je bila pozitivnost ločeno potrjena za vse tri markerje (slika 2).Zaradi narave vzorca in glede na to, da vzorčenje ni bilo opravljeno za namene klinične diagnostike, ampak za teste onesnaženosti okolja (ob upoštevanju tudi, da so bili filtri pred molekularno genetskimi analizami shranjeni vsaj štiri tedne, kotposledica italijanske zaustavitve), lahko potrdimo, da smo razumno dokazali prisotnost virusne RNA SARS-CoV-2 z odkrivanjem zelo specifičnega "gena RtDR" na 8 filtrih.Vendar pa zaradi pomanjkanja dodatnih materialov iz filtrov nismo mogli ponoviti dovolj testov, da bi pokazali pozitivnost za vse 3 molekularne markerje hkrati.
To je prvi preliminarni dokaz, da je SARS-CoV-2 RNA lahko prisotna na zunanjih trdnih delcih, kar nakazuje, da bi lahko SARS-CoV-2 v pogojih atmosferske stabilnosti in visokih koncentracij PM ustvaril grozde z zunanjimi PM in – z zmanjšanje njihovega difuzijskega koeficienta – povečati obstojnost virusa v ozračju.Dodatne potrditve tega predhodnegadokazi so v teku in bi morali vključevati oceno v realnem času o vitalnosti SARS-CoV-2 in njegovi virulenci, ko je adsorbiran na delce.Trenutno ni mogoče podati nobenih predpostavk o korelaciji med prisotnostjo virusa na PM in napredovanjem izbruha COVID-19.Druga vprašanja, ki jih je treba posebej obravnavati, so končne povprečne koncentracije delcevpotreben za morebiten "pospeševalni učinek" okužbe (v primeru, da se potrdi, da bi PM lahko deloval kot "prenašalec" za jedra virusnih kapljic) ali celo teoretična možnost imunizacije, ki je posledica izpostavljenosti minimalnim odmerkom pri nižjih pragovih PM. .
Slika 1 Krivulje pomnoževanja genov E (A) in RdRP (B): zelene črte predstavljajo testirane filtre;križne črtepredstavlja ekstrakcije referenčnega filtra;rdeče črte predstavljajo pomnožitev pozitivnih vzorcev.
Slika 2.Pozitivni rezultati (označeni z X) za gene E, N in RdRP, pridobljeni za vseh 34 vzorcev PM10filtrov, testiranih v drugi vzporedni analizi.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, Alessandro Miani8,9
1. Oddelek za industrijsko kemijo, Univerza v Bologni, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italija
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Medresorski center za industrijske raziskave »Obnovljivi viri, okolje, modra rast, energija«,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Oddelek za biologijo, Univerza “Aldo Moro” v Bariju, Bari, Italija
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Oddelek za kemijske in farmacevtske vede Univerze v Trstu, Trst, Italija
e-mail: barbierp@units.it
5. Oddelek za okoljske raziskave, TCR TECORA, Milano, Italija
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Oddelek za znanosti o življenju – Univerza v Trstu, Trst, Italija
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Oddelek za laboratorijsko medicino, Univerzitetna bolnišnica Giuliano Isontina (ASU GI), Trst, Italija
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italijansko združenje okoljske medicine (SIMA), Milano, Italija
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Oddelek za okoljske znanosti in politiko, Univerza v Milanu, Milano, Italija
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Odgovarjajoči avtor:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Reference
1. Svetovna zdravstvena organizacija, Načini prenosa virusa, ki povzroča COVID-19: posledice za previdnostna priporočila IPC, znanstveni povzetek;dostopno na: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29. marec 2020)
2. Italijansko ministrstvo za zdravje, dnevni bilten Izbruh Covid-19 v Italiji, na voljo na http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Evropska agencija za okolje, Poročilo o kakovosti zraka v Evropi 2019;št. 10/2019;Evropska agencija za okolje: Kopenhagen, Danska, na voljo na: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Exposure to air pollution and COVID-19 mortality in the United States, dostopno na: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italijansko združenje za okoljsko medicino (SIMA), poročilo o trdih delcih in COVID-19,
dostopno na: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Ali obstaja verjetna vloga za trdne delce pri širjenju COVID-19 v severni Italiji?, BMJ Rapid Responses, 8. april 2020, dostopno na: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Nastajanje drobnih delcev (PM2,5), kontaminiranih z virusom aviarne influence (AIV): odkrivanje genoma in kužnosti ter izračun imisije.Veterinarska mikrobiologija.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Prenos po zraku je morda igral vlogo pri širjenju izbruhov visoko patogene aviarne influence leta 2015 v Združene države.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Ocena vpliva prašnih pojavov na incidenco ošpic v zahodni Kitajski.Atmosfersko okolje.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Integrirani model za napoved atmosferskega širjenja virusa slinavke in parkljevke Epidemiol.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Nove smernice: prenos virusa slinavke in parkljevke po zraku, atmosfersko okolje, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Stopnje odlaganja virusov in bakterij nad atmosfersko mejno plastjo.Revija ISME.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Longitudinalna raziskava mikrobioma, povezanega s trdnimi delci v mega mestu.Biologija genoma.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Prenos po zraku je lahko
je igral vlogo pri širjenju izbruhov visoko patogene aviarne influence leta 2015 v Združenih državah.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Ocena vpliva prašnih dogodkov na incidenco ošpic na zahodnem Kitajskem.Atmosfersko okolje.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Optimizirana ekstrakcija DNA in metagenomsko sekvenciranje mikrobnih skupnosti v zraku .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Zbiranje, določanje velikosti delcev in odkrivanje virusov v zraku.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, opis izdelka, na voljo na: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, opis izdelka, na voljo na: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Odkrivanje novega koronavirusa 2019 (2019-nCoV) z RT-PCR v realnem času.Eurosurveillance, 25(3), na voljo na:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Original: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Čas objave: 18. aprila 2020