Тяжелый острый респираторный синдром, известный как заболевание COVID-19, вызванное вирусом SARS-CoV-2, распространяется воздушно-капельным путем и при тесных контактах.[1] Бремя COVID-19 было чрезвычайно тяжелым в Ломбардии и долине реки По (Северная Италия)[2], области, которая характеризуется высокой концентрацией твердых частиц, которые, как уже известно, оказывают негативное воздействие на здоровье человека.[3] Региональные данные по Италии на 12 апреля показывают, что около 30% в настоящее время положительных людей по-прежнему проживают в Ломбардии (около 40%, если учитывать общее количество случаев, подтвержденных с начала эпидемии), за которой следуют Эмилия-Романья (13,5%), Пьемонт (10,5%) и Венето (10%).[2] На эти четыре региона долины реки По приходится 80% от общего числа смертей, зарегистрированных в Италии, и 65% госпитализаций в отделения интенсивной терапии.[2]
Исследование, проведенное Гарвардской школой общественного здравоохранения, похоже, подтверждает связь между увеличением концентрации PM и показателями смертности из-за COVID-19 в США[4]. В предыдущих сообщениях мы выдвинули гипотезу о возможности того, что вирус SARS-CoV-2 может присутствовать на твердых частицах (PM) во время распространения инфекции[5,6], что согласуется с уже полученными доказательствами.
доступны для других вирусов.[7-15] Однако вопрос микробиома, связанного с PM в воздухе, особенно в городских условиях, остается в значительной степени недостаточно изученным,[16] и – на данный момент – никто еще не проводил экспериментальных исследований, специально направленных на подтверждение или исключение присутствия SARS-CoV-2 на PM.
Здесь мы представляем первые результаты анализов, которые мы провели на 34 образцах PM10 наружного/воздушного происхождения с промышленного объекта в провинции Бергамо, собранных двумя различными пробоотборниками воздуха в течение непрерывного трехнедельного периода с 21 февраля по 13 марта.
Следуя методологии, описанной Паном и соавторами в 2019 году (для сбора, измерения размера частиц и обнаружения вирусов в воздухе),[17] образцы PM собирались на кварцевых фильтрах с помощью малообъемного гравиметрического пробоотборника воздуха (38,3 л/мин в течение 23 ч), соответствующего эталонному методу EN12341:2014 для мониторинга PM10. Твердые частицы улавливались на фильтрах с типичной степенью улавливания 99,9%.Удержание аэрозоля, правильное хранение и доставка в лабораторию прикладной и сравнительной геномики Триестского университета. Учитывая «экологическую» природу образца, предположительно богатого ингибиторами ДНК-полимераз, мы приступили к выделению РНК с помощью набора Quick RNA Fecal Soil Microbe Kit, адаптированного к типу фильтров.[18] Половина фильтра была свернута верхней стороной внутрь.в полипропиленовой пробирке объёмом 5 мл вместе с гранулами, входящими в комплект. Из исходного 1 мл лизирующего буфера нам удалось получить около 400 мкл раствора, который затем обработали в соответствии со стандартными протоколами, получив конечный элюат объёмом 15 мкл. Впоследствии 5 мкл были использованы для тестирования на SARS-CoV-2. Учитывая особенности происхождения образца, была использована смесь qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix [19]. Системы амплификации были использованы в соответствии с протоколом, разработанным Корманом и соавторами, опубликованным на сайте ВОЗ [20].
Тест был направлен на подтверждение или исключение присутствия РНК SARS-CoV-2 в твердых частицах. Первый анализ использовал ген E в качестве молекулярного маркера и дал впечатляющий положительный результат на 15 из 16 фильтров, даже если, как и ожидалось, Ct находился в диапазоне 36–38 циклов.
После этого мы повторили анализ на 6 положительных фильтрах (уже положительных по «гену E»), используя «ген RtDR» в качестве молекулярного маркера, который является высокоспецифичным для SARS-CoV-2, и получили 5 значимых положительных результатов; также были успешно проведены контрольные тесты для исключения ложноположительных результатов (рис. 1).
Чтобы избежать исчерпания дефицитного материала для образцов, оставшиеся выделенные РНК были доставлены в местную университетскую больницу (один из клинических центров, уполномоченных правительством Италии проводить диагностические тесты на SARS-CoV-2) для проведения второго параллельного слепого теста. Эта вторая клиническая лаборатория протестировала 34 выделения РНК для генов E, N и RdRP, зарегистрировав 7 положительных результатов как минимум для одного из трех генов-маркеров, причем положительный результат был подтвержден отдельно для всех трех маркеров (рис. 2). В связи с природой образца и тем, что отбор проб проводился не для целей клинической диагностики, а для испытаний на загрязнение окружающей среды (принимая во внимание также, что фильтры хранились не менее четырех недель до проведения молекулярно-генетического анализа, а(вследствие закрытия в Италии) мы можем подтвердить, что убедительно продемонстрировали наличие вирусной РНК SARS-CoV-2, обнаружив высокоспецифичный «ген RtDR» на восьми фильтрах. Однако из-за отсутствия дополнительных материалов с фильтров нам не удалось повторить достаточное количество тестов, чтобы одновременно получить положительный результат по всем трём молекулярным маркерам.
Это первое предварительное доказательство того, что РНК SARS-CoV-2 может присутствовать на твердых частицах на открытом воздухе, что позволяет предположить, что в условиях стабильной атмосферы и высокой концентрации взвешенных частиц SARS-CoV-2 может создавать кластеры с твердыми частицами на открытом воздухе и, снижая их коэффициент диффузии, усиливать устойчивость вируса в атмосфере. Дальнейшие подтверждения этого предварительного доказательстваДанные продолжают поступать и должны включать оценку жизнеспособности SARS-CoV-2 в режиме реального времени, а также его вирулентности при адсорбции на твердых частицах. В настоящее время невозможно сделать никаких предположений относительно корреляции между присутствием вируса на частицах PM и прогрессированием вспышки COVID-19. Другие вопросы, требующие особого внимания, – это средние концентрации частиц PM в конечном итоге.требуется для потенциального «усиливающего эффекта» заражения (в случае подтверждения того, что PM может выступать в качестве «носителя» ядер вирусных капель), или даже теоретической возможности иммунизации в результате воздействия минимальной дозы при более низких порогах PM.
Рис.1 Кривые амплификации генов E (A) и RdRP (B): зеленые линии представляют собой протестированные фильтры; перекрестные линиипредставляет собой экстракцию контрольного фильтра; красные линии представляют собой амплификацию положительных образцов.
Рис. 2. Положительные результаты (отмечены знаком X) для генов E, N и RdRP, полученные для всех 34 образцов PM10.фильтры, протестированные во втором параллельном анализе.
Леонардо Сетти1, Фабрицио Пассарини2, Джанлуиджи Де Дженнаро3, Пьерлуиджи Барбьери4, Мария Грация Перроне5, Массимо Борелли6, Джоланда Пальмисани3, Алессия Ди Джилио3, Валентина Торболи6, Альберто Паллавичини6, Маурицио Русчо7, Приско Писцителли8, Алессандро Миани8,9
1. Кафедра промышленной химии, Болонский университет, Виале дель Рисорджименто – 4, I-40136, Болонья, Италия
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Межведомственный центр промышленных исследований «Возобновляемые источники, окружающая среда, синий рост, энергетика»,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Кафедра биологии, Университет «Альдо Моро» в Бари, Бари, Италия
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Кафедра химических и фармацевтических наук, Университет Триеста, Триест, Италия
e-mail: barbierp@units.it
5. Отдел исследований окружающей среды, TCR TECORA, Милан, Италия
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Кафедра естественных наук – Университет Триеста, Триест, Италия
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Отделение лабораторной медицины, Университетская больница Джулиано Изонтина (ASU GI), Триест, Италия.
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Итальянское общество экологической медицины (SIMA), Милан, Италия
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Кафедра наук об окружающей среде и политике, Миланский университет, Милан, Италия
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Автор-корреспондент:
Леонардо Сетти, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Ссылки
1. Всемирная организация здравоохранения, «Пути передачи вируса, вызывающего COVID-19: значение для рекомендаций по мерам предосторожности в рамках ПИИК», Научный обзор; доступно по адресу: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 марта 2020 г.)
2. Министерство здравоохранения Италии, ежедневный бюллетень о вспышке COVID-19 в Италии, доступен по адресу http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. ЕАОС (Европейское агентство по охране окружающей среды), Отчет о качестве воздуха в Европе за 2019 год; № 10/2019; Европейское агентство по охране окружающей среды: Копенгаген, Дания, доступно по адресу: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Сяо У, Рэйчел К. Нетери, М. Бенджамин Сабат, Даниэль Браун, Франческа Доминичи, Воздействие загрязнения воздуха и смертность от COVID-19 в США, доступно по адресу: https://projects.iq.harvard.edu/files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Итальянское общество экологической медицины (SIMA), Аналитическая записка «Твердые частицы и COVID-19»,
доступно по адресу: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Сетти Л., Пассарини Ф., Де Дженнаро Г., Барбьери П., Перроне М.Г., Пьяццалунга А., Борелли М., Пальмисани Дж., Ди Джилио А., Писцителли П., Миани А., Существует ли правдоподобная роль твердых частиц в распространении COVID-19 в Северной Италии?, BMJ Rapid Responses, 8 апреля 2020 г., доступно по адресу: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Генерация фекальных частиц (PM2,5), контаминированных вирусом гриппа птиц (ВГП): определение генома и инфекционности, а также расчет иммиссии. Ветеринарная микробиология. 139, 156–164 (2009).
8. Чжао, И., Ричардсон, Б., Такл, Э., Чай, Л., Шмитт, Д., Вин, Х. Воздушно-капельный путь передачи мог сыграть роль в распространении высокопатогенного птичьего гриппа в США в 2015 году. Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ма, И., Чжоу, Д., Ян, С., Чжао, И., Чжэн, С. Оценка влияния пылевых событий на заболеваемость корью в Западном Китае. Атмосферная среда. 157, 1–9 (2017)
10. Соренсен, Дж. Х., Маккей, Д. К. Дж., Дженсен, К. О., Дональдсон, А. И. Интегрированная модель для прогнозирования распространения вируса ящура в атмосфере. Эпидемиол. Инфекция, 124, 577–590 (2000)
11. Глостера, Дж., Александерсен, С. Новые направления: Воздушная передача вируса ящура. Атмосферная среда, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Рече, И., Д'Орта, Г., Младенов, Н., Уингет, Д.М., Саттл, К.А. Скорость осаждения вирусов и бактерий выше пограничного слоя атмосферы. Журнал ISME. 12, 1154–1162 (2018).
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF. Лонгитюдное исследование микробиома, связанного с твердыми частицами в мегаполисе. Геномная биология. 21, 55 (2020).
14. Чжао, Ю., Ричардсон, Б., Такл, Э., Чай, Л., Шмитт, Д., Вин, Х. Воздушно-капельный путь передачи может иметь
сыграли роль в распространении вспышек высокопатогенного птичьего гриппа в Соединенных Штатах в 2015 году.
Отчет 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ма, И., Чжоу, Д., Ян, С., Чжао, И., Чжэн, С. Оценка влияния пылевых событий на заболеваемость корью в Западном Китае. Атмосферная среда. 157, 1–9 (2017)
16. Цзян, В., Лэйнг, П., Ван, Б., Фан, Дж., Лан, Дж., Тянь, Г., Цзян, Дж., Чжу, Т.Ф. Оптимизированное выделение ДНК и метагеномное секвенирование микробных сообществ в воздухе. Nat. Protoc. 10, 768-779 (2015)
17. Пан, М., Ледницкий, Дж. А., Ву, Ч.-Й., Сбор, определение размера частиц и обнаружение вирусов, передающихся воздушно-капельным путем. Журнал прикладной микробиологии, 127, 1596–1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, описание продукта доступно по адресу: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, описание продукта доступно по адресу: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Корман В.М., Ландт О., Кайзер М., Моленкамп Р., Мейер А., Чу Д.К. и Малдерс Д.Г. (2020).
Выявление нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Eurosurveillance, 25(3), доступно по ссылке: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Оригинал: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Время публикации: 18 апреля 2020 г.
