Sindromul respirator acut sever, cunoscut sub numele de boală COVID-19 – din cauza virusului SARS-CoV-2 – este recunoscut că se răspândește prin picături respiratorii și prin contacte strânse.[1]Povara COVID-19 a fost extrem de severă în Lombardia și Valea Po (nordul Italiei),[2] o zonă caracterizată prin concentrații mari de particule, despre care se știe deja că produc efecte negative asupra sănătății umane.[3]Cifrele regionale disponibile pentru Italia la data de 12 aprilie arată că aproximativ 30% dintre persoanele pozitive în prezent locuiesc încă în Lombardia (aproximativ 40% dacă luăm în considerare totalul cazurilor confirmate de la începutul epidemiei), urmată de Emilia Romagna (13,5%). , Piemont (10,5%) și Veneto (10%).[2]Aceste patru regiuni din Valea Po reprezintă 80% din totalul deceselor înregistrate în Italia și 65% din internările în Unitățile de Terapie Intensivă.[2]
O cercetare efectuată de Școala de Sănătate Publică Harvard pare să confirme o asociere între creșterile concentrațiilor de PM și ratele de mortalitate din cauza COVID-19 în SUA[4] În comunicările anterioare, am emis ipoteza că SARS-CoV-2 virusul ar putea fi prezent pe particulele (PM) în timpul răspândirii infecției,[5,6] în conformitate cu dovezile deja
disponibil pentru alți virusuri.[7-15] Cu toate acestea, problema microbiomului asociat PM din aer, în special în mediile urbane, rămâne în mare parte subinvestigată,[16] și – în prezent – nimeni nu a efectuat încă studii experimentale care vizează în mod specific la confirmarea sau excluderea prezenței SARS-CoV-2 la PM.
Vă prezentăm aici primele rezultate ale analizelor pe care le-am efectuat pe 34 de mostre de PM10 de PM10 în aer liber/aer de la un sit industrial din provincia Bergamo, colectate cu două probe diferite de aer pe o perioadă continuă de 3 săptămâni, din 21 februarie până în martie. al 13-lea.
Urmând metodologia descrisă de Pan et al.în 2019 (pentru colectarea, dimensionarea particulelor și detectarea virusurilor aeropurtate),[17] probe de PM au fost colectate pe filtre cu fibre de cuarț folosind un prelevator gravimetric de aer de volum mic (38,3 l/min timp de 23 h), conform cu metoda de referință EN12341 :2014 pentru monitorizarea PM10.Particulele au fost prinse pe filtre cu 99,9% tipicretenție de aerosoli, depozitat corespunzător și livrat la laboratorul de Genomică Aplicată și Comparată al Universității din Trieste.Având în vedere natura „de mediu” a probei, probabil bogată în inhibitori ai ADN polimerazei, am procedat la extracția ARN-ului utilizând kitul Quick RNA pentru microbii din sol fecal, adaptat tipului de filtre.[18]Jumătate de filtru a fost rulată, cu partea superioară îndreptată spre interior,intr-un tub de polipropilena de 5 ml, impreuna cu margelele furnizate in kit.Din 1 ml inițial de tampon de liză, am reușit să obținem aproximativ 400 ul de soluție, care a fost apoi procesată conform protocoalelor standard, rezultând un eluat final de 15 ul.Ulterior, 5 ul au fost utilizate pentru testarea SARS-CoV-2.Având în vedere originea particulară a probei, a fost folosit qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Sistemele de amplificare au fost cele ale protocolului dezvoltat de Corman et al, publicat pe site-ul OMS [20].
Testul a vizat în mod explicit confirmarea sau excluderea prezenței ARN-ului SARS-CoV-2 pe particule.Prima analiză a folosit „gena E” ca marker molecular și a produs un rezultat pozitiv impresionant pe 15 din 16 filtre, chiar dacă, așa cum ne-am putea aștepta, Ct a fost între 36-38 de cicluri.
După aceea, am replicat analiza pe 6 dintre filtrele pozitive (deja pozitive la „gena E”) utilizând „gena RtDR” ca marker molecular – care este foarte specific pentru SARS-CoV-2 – ajungând la 5 rezultate semnificative. de pozitivitate;au fost de asemenea efectuate cu succes teste de control pentru a exclude pozitivitatea falsă (Fig. 1).
Pentru a evita epuizarea materialului limitat de prelevare disponibil, restul de ARN extras au fost livrate Spitalului Universitar local (unul dintre centrele clinice autorizate de guvernul italian pentru teste de diagnosticare SARS-CoV-2), pentru a efectua un al doilea test paralel orb.Acest al doilea laborator clinic a testat 34 de extracții de ARN pentru genele E, N și RdRP, raportând 7 rezultate pozitive pentru cel puțin una dintre cele trei gene marker, cu pozitivitatea confirmată separat pentru toți cei trei markeri (Fig. 2).Din cauza naturii probei și având în vedere că eșantionarea nu a fost efectuată în scopuri de diagnostic clinic, ci pentru teste de poluare a mediului (ținând cont și de faptul că filtrele au fost depozitate timp de cel puțin patru săptămâni înainte de a fi supuse analizelor genetice moleculare, deoareceo consecință a opririi din Italia), putem confirma că am demonstrat în mod rezonabil prezența ARN viral SARS-CoV-2 prin detectarea „genei RtDR” foarte specifice pe 8 filtre.Cu toate acestea, din cauza lipsei de materiale suplimentare din filtre, nu am putut repeta un număr suficient de teste pentru a arăta pozitivitatea pentru toți cei 3 markeri moleculari simultan.
Aceasta este prima dovadă preliminară că ARN-ul SARS-CoV-2 poate fi prezent pe particulele exterioare, sugerând astfel că, în condiții de stabilitate atmosferică și concentrații mari de PM, SARS-CoV-2 ar putea crea clustere cu PM în exterior și – prin reducerea coeficientului lor de difuzie – sporește persistența virusului în atmosferă.Confirmări suplimentare ale acestui preliminardovezile sunt în curs de desfășurare și ar trebui să includă o evaluare în timp real a vitalității SARS-CoV-2, precum și a virulenței acestuia atunci când este adsorbit pe particule.În prezent, nu se pot face ipoteze cu privire la corelația dintre prezența virusului pe PM și progresia focarului de COVID-19.Alte probleme care trebuie abordate în mod specific sunt concentrațiile medii de PM în cele din urmănecesar pentru un potențial „efect de stimulare” al contagiunii (în cazul în care se confirmă că PM ar putea acționa ca un „purtător” pentru nucleele picăturilor virale), sau chiar posibilitatea teoretică de imunizare ca urmare a expunerii la doze minime la praguri mai mici de PM .
Fig.1 Curbele de amplificare ale genelor E (A) și RdRP (B): liniile verzi reprezintă filtrele testate;linii încrucișatereprezintă extracțiile filtrului de referință;liniile roșii reprezintă amplificarea probelor pozitive.
Fig.2.Rezultate pozitive (marcate cu X) pentru genele E, N și RdRP obținute pentru toate probele de 34 PM10filtre testate în a doua analiză paralelă.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, Alessandro Miani8,9
1. Departamentul Chimie Industrială, Universitatea din Bologna, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italia
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Centrul Interdepartamental de Cercetare Industrială „Surse regenerabile, mediu, creștere albastră, energie”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Departamentul de Biologie, Universitatea „Aldo Moro” din Bari, Bari, Italia
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Departamentul de Științe Chimice și Farmaceutice, Universitatea din Trieste, Trieste, Italia
e-mail: barbierp@units.it
5. Divizia de cercetare de mediu, TCR TECORA, Milano, Italia
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Departamentul de Științe Vieții – Universitatea din Trieste, Trieste, Italia
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Divizia de Medicină de Laborator, Spitalul Universitar Giuliano Isontina (ASU GI), Trieste, Italia
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Societatea Italiană de Medicină a Mediului (SIMA), Milano, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Departamentul de Științe ale Mediului și Poicy, Universitatea din Milano, Milano, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Autorul corespunzator:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Referințe
1. Organizația Mondială a Sănătății, Moduri de transmitere a virusului care provoacă COVID-19: implicații pentru recomandările de precauție IPC, brief științific;disponibil la: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 martie 2020)
2. Ministerul italian al Sănătății, buletinul zilnic Focar de Covid-19 în Italia, disponibil la http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. SEE, Agenția Europeană de Mediu, Raportul Calitatea aerului în Europa 2019;nr 10/2019;Agenția Europeană de Mediu: Copenhaga, Danemarca, disponibil la: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Exposure to air pollution and COVID-19 mortality in the United States, disponibil la: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Societatea Italiană de Medicină a Mediului (SIMA), documentul de poziție, particulele și COVID-19,
disponibil la: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Is there a Plausible Role pentru particule în suspensie în răspândirea COVID-19 în nordul Italiei?, BMJ Rapid Responses, 8 aprilie 2020, disponibil la: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generarea de particule fine fecale contaminate cu virusul gripei aviare (AIV) (PM2,5): detectarea genomului și infecțiozității și calculul immisiei.Microbiologie veterinară.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Este posibil ca transmiterea prin aer să fi jucat un rol în răspândirea focarelor de gripă aviară foarte patogenă din 2015 în Statele Unite.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Evaluarea impactului evenimentelor de praf asupra incidenței rujeolei în vestul Chinei.Mediul atmosferic.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Un model integrat pentru a prezice răspândirea atmosferică a virusului febrei aftoase Epidemiol.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. New Directions: Airborne Transmission of Foot-and-Mouth Disease Virus Atmospheric Environment, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Ratele de depunere a virusurilor și bacteriilor deasupra stratului limită atmosferic.Jurnalul ISME.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H. ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Studiu longitudinal al microbiomului asociat cu particulele într-un megaoraș.Biologia genomului.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Transmisia aeropurtată poate avea
a jucat un rol în răspândirea focarelor de gripă aviară foarte patogenă din 2015 în Statele Unite.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Evaluarea impactului evenimentelor de praf asupra incidenței rujeolei în vestul Chinei.Mediul atmosferic.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Extracția ADN optimizată și secvențierea metagenomică a comunităților microbiene din aer .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Colectarea, dimensionarea particulelor și detectarea virusurilor din aer.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, descrierea produsului, disponibilă la: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, descrierea produsului, disponibilă la: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK și Mulders, DG (2020).
Detectarea noului coronavirus din 2019 (2019-nCoV) prin RT-PCR în timp real.Eurosurveillance, 25(3), disponibil la:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Original: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Ora postării: 18-apr-2020