תסמונת נשימתית חריפה חמורה הידועה כמחלת COVID-19 - עקב נגיף SARS-CoV-2 - מוכרת כמתפשטת באמצעות טיפות נשימתיות ומגע קרוב.[1]הנטל של COVID-19 היה חמור ביותר בלומברדיה ובעמק פו (צפון איטליה),[2] אזור המאופיין בריכוזים גבוהים של חלקיקים, שכבר ידועים כמייצרים השפעות שליליות על בריאות האדם.[3]נתונים אזוריים זמינים עבור איטליה בתאריך 12 באפריל מראים שכ-30% מהאנשים החיוביים כיום עדיין חיים בלומברדיה (כ-40% אם לוקחים בחשבון את המקרים הכוללים שאושרו מתחילת המגיפה), ואחריהם אמיליה רומניה (13.5%) , פיימונטה (10.5%), ונטו (10%).[2]ארבעת האזורים הללו של עמק הפו מהווים 80% מסך מקרי המוות שנרשמו באיטליה ו-65% מהאשפוזים ביחידות לטיפול נמרץ.[2]
נראה כי מחקר שבוצע על ידי בית הספר לבריאות הציבור של הרווארד מאשר קשר בין עלייה בריכוזי PM לבין שיעורי תמותה כתוצאה מ-COVID-19 בארה"ב[4] בתקשורת קודמת, שיערנו את האפשרות ש-SARS-CoV-2 נגיף יכול להיות נוכח על חלקיקים (PM) במהלך התפשטות הזיהום,[5,6] בהתאם לראיות שכבר
זמין עבור וירוסים אחרים.[7-15] עם זאת, הנושא של מיקרוביום PM הקשור באוויר, במיוחד בסביבות עירוניות, עדיין לא נחקר במידה רבה, [16] וכרגע אף אחד עדיין לא ביצע מחקרים ניסיוניים שמטרתם ספציפית באישור או אי הכללה של נוכחות SARS-CoV-2 ב-PM.
כאן, אנו מציגים את התוצאות הראשונות של הניתוחים שביצענו על 34 דגימות PM10 של PM10 חיצוני/מוטס מאתר תעשייתי של מחוז ברגמו, שנאספו עם שני דגמי אוויר שונים לאורך תקופה רציפה של 3 שבועות, מה-21 בפברואר ועד למרץ. ה-13.
בעקבות המתודולוגיה שתוארה על ידי Pan et al.בשנת 2019 (לאיסוף, גודל חלקיקים וזיהוי של וירוסים הנישאים באוויר),[17] דגימות PM נאספו על מסנני סיבי קוורץ באמצעות דגימת אוויר גרבימטרית בנפח נמוך (38.3 ליטר לדקה למשך 23 שעות), התואמת לשיטת הייחוס EN12341 :2014 לניטור PM10.חלקיקים נלכדו על גבי מסננים עם 99.9% אופיינייםשימור אירוסול, מאוחסן כראוי ומועבר למעבדה של גנומיקה יישומית והשוואתית של אוניברסיטת טריאסטה.בהתחשב באופי ה"סביבתי" של הדגימה, ככל הנראה עשירה במעכבי פולימראזות DNA, המשכנו עם מיצוי ה-RNA באמצעות ערכת חיידקי האדמה הצואה של Quick RNA המותאמת לסוג המסננים.[18]חצי מסנן התגלגל, כשהצד העליון פונה פנימה,בשפופרת פוליפרופילן של 5 מ"ל, יחד עם החרוזים המסופקים בערכה.מ-1 מ"ל הראשוני של lysisbuffer, הצלחנו לקבל כ-400 ul של תמיסה, שעובדה לאחר מכן כפי שהוגדרה על ידי הפרוטוקולים הסטנדרטיים, וכתוצאה מכך התקבלה eluate סופי של 15 ul.לאחר מכן, 5 ul שימשו לבדיקת SARS-CoV-2.בהתחשב במקור המסוים של המדגם, נעשה שימוש ב-qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]מערכות ההגברה היו אלה של הפרוטוקול שפותח על ידי Corman et al, שפורסם באתר WHO [20].
הבדיקה נועדה במפורש לאשר או לשלול נוכחות של SARS-CoV-2 RNA על חלקיקים.הניתוח הראשון השתמש ב"גן E" כסמן מולקולרי והניב תוצאה חיובית מרשימה ב-15 מתוך 16 מסננים גם אם, כפי שניתן היה לצפות, ה-Ct היה בין 36-38 מחזורים.
לאחר מכן, שיכפלנו את הניתוח על 6 מהפילטרים החיוביים (כבר חיוביים ל"גן E") באמצעות "גן RtDR" כסמן מולקולרי - שהוא מאוד ספציפי ל-SARS-CoV-2 - והגענו ל-5 תוצאות משמעותיות של חיוביות;כמו כן בוצעו בהצלחה בדיקות בקרה למניעת חיוביות כוזבת (איור 1).
כדי למנוע אוזל של חומר הדגימה הדל הזמין, שאר ה-RNA שחולצו הועברו לבית החולים האוניברסיטאי המקומי (אחד מהמרכזים הקליניים המורשים על ידי ממשלת איטליה לבדיקות אבחון SARS-CoV-2), על מנת לבצע שנייה מבחן עיוור מקביל.מעבדה קלינית שנייה זו בדקה 34 מיצוי RNA עבור הגנים E, N ו-RdRP, ודיווחה על 7 תוצאות חיוביות עבור לפחות אחד משלושת הגנים של הסמן, כאשר חיוביות מאושרת בנפרד עבור כל שלושת הסמנים (איור 2).בגלל אופי הדגימה, ובהתחשב בכך שהדגימה לא בוצעה למטרות אבחון קליני אלא לבדיקות זיהום סביבתי (בהתחשב גם בכך שמסננים אוחסנו לפחות ארבעה שבועות לפני שעברו ניתוחים גנטיים מולקולריים, שכןכתוצאה מהכיבוי האיטלקי), אנו יכולים לאשר שהדגמנו באופן סביר את נוכחותו של RNA ויראלי SARS-CoV-2 על ידי זיהוי "גן RtDR" ספציפי מאוד על 8 מסננים.עם זאת, בשל היעדר חומרים נוספים מהפילטרים, לא הצלחנו לחזור על מספר מספיק של בדיקות כדי להראות חיוביות עבור כל 3 הסמנים המולקולריים בו זמנית.
זוהי ההוכחה המוקדמת הראשונה לכך ש-SARS-CoV-2 RNA יכול להיות קיים על חלקיקי חוץ, ובכך מציעה שבתנאים של יציבות אטמוספרית וריכוזים גבוהים של PM, SARS-CoV-2 יכול ליצור אשכולות עם PM חיצוני ו - על ידי הפחתת מקדם הדיפוזיה שלהם - משפרת את התמדה של הנגיף באטמוספרה.אישורים נוספים לראשוני זההראיות מתמשכות, וצריכות לכלול הערכה בזמן אמת לגבי חיוניות ה-SARS-CoV-2 וכן את הארסיות שלו כאשר הוא נספג על חלקיקים.נכון לעכשיו, לא ניתן להניח הנחות לגבי המתאם בין נוכחות הנגיף ב-PM לבין התקדמות התפרצות COVID-19.נושאים נוספים שיש להתייחס אליהם באופן ספציפי הם הריכוזים הממוצעים של PM בסופו של דברנדרש עבור "אפקט חיזוק" פוטנציאלי של ההדבקה (במקרה שיאושר ש-PM עשוי לשמש כ"נשא" עבור גרעיני טיפות הנגיף), או אפילו האפשרות התיאורטית של חיסון כתוצאה מחשיפת מינון מינימלי בספים נמוכים יותר של PM. .
איור 1 עקומות הגברה של גנים E (A) ו-RdRP (B): קווים ירוקים מייצגים מסננים שנבדקו;חוצים קוויםמייצג מיצוי מסנן התייחסות;קווים אדומים מייצגים את ההגברה של הדגימות החיוביות.
איור 2.תוצאות חיוביות (מסומנות ב-X) עבור גנים E, N ו-RdRP שהתקבלו עבור כל דגימת 34 PM10מסננים שנבדקו בניתוח המקביל השני.
ליאונרדו סטי1, פבריציו פסאריני2, ג'יאנלואיג'י דה ג'נארו3, פיירלואיג'י ברביירי4, מריה גרציה פרונה5, מאסימו בורלי6, ג'ולנדה פלמיסאני3, אלסיה די גיליו3, ולנטינה טורבולי6, אלברטו פאלביצ'יני6, מאוריציו רוסיו7, פריסקו פיסיטלי 8, A9,
1. המחלקה לכימיה תעשייתית, אוניברסיטת בולוניה, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, בולוניה, איטליה
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. מרכז בין-משרדי למחקר תעשייתי "מקורות מתחדשים, סביבה, צמיחה כחולה, אנרגיה",
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. החוג לביולוגיה, אוניברסיטת "אלדו מורו" מבארי, בארי, איטליה
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. המחלקה למדעי הכימיה והפרמצבטיקה, אוניברסיטת טריאסטה, טריאסטה, איטליה
e-mail: barbierp@units.it
5. חטיבת מחקר סביבתי, TCR TECORA, מילאנו, איטליה
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. המחלקה למדעי החיים – אוניברסיטת טריאסטה, טריאסטה, איטליה
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. המחלקה לרפואת מעבדה, בית החולים האוניברסיטאי ג'וליאנו איזונטינה (ASU GI), טריאסטה, איטליה
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. החברה האיטלקית לרפואה סביבתית (SIMA), מילאנו, איטליה
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. המחלקה למדעי הסביבה ועניין, אוניברסיטת מילאנו, מילאנו, איטליה
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
מחבר מקביל:
לאונרדו סטי, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
הפניות
1. ארגון הבריאות העולמי, דרכי העברה של וירוס הגורם ל-COVID-19: השלכות על המלצות זהירות של IPC, תסקיר מדעי;זמין בכתובת: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 במרץ 2020)
2. משרד הבריאות האיטלקי, עלון יומי של התפרצות קוביד-19 באיטליה, זמין בכתובת http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, הסוכנות האירופית לאיכות הסביבה, דו"ח איכות האוויר באירופה 2019;מס' 10/2019;הסוכנות האירופית לאיכות הסביבה: קופנהגן, דנמרק, זמין בכתובת: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, חשיפה לזיהום אוויר ותמותה מ-COVID-19 בארצות הברית, זמין בכתובת: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. החברה האיטלקית לרפואה סביבתית (SIMA), נייר עמדה חלקיקי חומר ו-COVID-19,
זמין בכתובת: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Is there a Plausible Role עבור חלקיקים בהתפשטות COVID-19 בצפון איטליה?, BMJ Rapid Responses, 8 באפריל 2020, זמין בכתובת: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. גילוי גנום וזיהומיות וחישוב ספיגה.מיקרוביולוגיה וטרינרית.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. שידור מוטס אולי שיחק תפקיד בהפצת התפרצויות שפעת העופות הפתוגניות ביותר ב-2015 ארצות הברית.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. הערכה להשפעה של אירועי אבק על שכיחות חצבת במערב סין.סביבה אטמוספרית.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI מודל משולב לניבוי התפשטות האטמוספירה של נגיף הפה והטלפיים Epidemiol.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. New Directions: העברה באוויר של סביבה אטמוספרית של וירוס מחלות רגל ובל פה, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA שיעורי שיקוע של וירוסים וחיידקים מעל שכבת הגבול האטמוספירית.כתב העת ISME.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H. ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF סקר אורך של מיקרוביום הקשור לחומר חלקיקי במגה-עיר.ביולוגיה של הגנום.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. שידור מוטס עשוי להיות
מילא תפקיד בהתפשטות התפרצויות שפעת העופות הפתוגניות ביותר בשנת 2015 בארצות הברית.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. הערכה להשפעה של אירועי אבק על שכיחות חצבת במערב סין.סביבה אטמוספרית.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J.,Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF מיצוי DNA אופטימלי ורצף מטאנומי של קהילות מיקרוביאליות מוטסות .נאט.פרוטוק.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., איסוף, גודל חלקיקים וזיהוי של וירוסים מוטסים.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, תיאור המוצר, זמין בכתובת: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, תיאור המוצר, זמין בכתובת: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
זיהוי של נגיף קורונה חדש לשנת 2019 (2019-nCoV) על ידי RT-PCR בזמן אמת.Eurosurveillance, 25(3), זמין בכתובת:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
מקורי: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
זמן פרסום: 18 באפריל 2020