SARS-Cov-2 RNA fannst á svifryki í Bergamo á Norður-Ítalíu: Fyrstu bráðabirgðasönnunargögn

Alvarlegt brátt öndunarfæraheilkenni þekkt sem COVID-19 sjúkdómur – vegna SARS-CoV-2 veiru – er viðurkennt að dreifast með öndunardropum og nánum snertingu.[1]Álagið af COVID-19 var afar alvarlegt í Langbarðalandi og Po-dalnum (Norður-Ítalíu),[2] svæði sem einkennist af miklum styrk svifryks, sem þegar er vitað að hefur neikvæð áhrif á heilsu manna.[3]Svæðislegar tölur fyrir Ítalíu þann 12. apríl sýna að um 30% af fólki sem er jákvætt býr enn í Langbarðalandi (um 40% ef miðað er við heildartilvikin sem voru staðfest frá upphafi faraldursins), þar á eftir Emilia Romagna (13,5%) , Piedmont (10,5%) og Veneto (10%).[2]Þessi fjögur svæði í Po-dalnum standa fyrir 80% af heildar dauðsföllum sem skráð eru á Ítalíu og 65% af innlögnum á gjörgæsludeildir.[2]

Rannsókn á vegum Harvard School of Public Health virðist staðfesta tengsl á milli aukningar á styrk PM og dánartíðni vegna COVID-19 í Bandaríkjunum[4] Í fyrri samskiptum höfum við sett fram tilgátu um að SARS-CoV-2 veira gæti verið til staðar á svifryki (PM) við útbreiðslu sýkingarinnar, [5,6] í samræmi við vísbendingar sem þegar
í boði fyrir aðrar vírusar.[7-15] Hins vegar er vandamálið um PM-tengda örveru í lofti, sérstaklega í borgarumhverfi, enn að mestu vanrannsökuð,[16] og - eins og er - hefur enginn enn framkvæmt tilraunarannsóknir sem sérstaklega miða að við að staðfesta eða útiloka tilvist SARS-CoV-2 á PM.
Hér kynnum við fyrstu niðurstöður greininganna sem við höfum framkvæmt á 34 PM10 sýnum af PM10 utandyra/loftborið frá iðnaðarsvæði í Bergamo héraði, safnað með tveimur mismunandi loftsýnum á samfelldu 3 vikna tímabili, frá 21. febrúar til mars. 13.
Eftir aðferðafræðinni sem Pan o.fl.árið 2019 (fyrir söfnun, kornastærð og greiningu loftborinna vírusa),[17] PM sýnum var safnað á kvarstrefjasíur með því að nota lágmagns þyngdarmælingartæki (38,3 l/mín í 23 klst), í samræmi við viðmiðunaraðferðina EN12341 :2014 fyrir PM10 eftirlit.Svifryk voru föst á síum með 99,9% dæmigerðvarðveisla úðabrúsa, geymd á réttan hátt og afhent rannsóknarstofu í hagnýtri og samanburðarfræðilegri erfðafræði við Trieste háskólann.Með hliðsjón af „umhverfislegu“ eðli sýnisins, sem er væntanlega ríkt af hemlum á DNA pólýmerasa, héldum við áfram með útdrátt RNA með því að nota Quick RNA saur jarðvegs örverusettið sem er aðlagað að gerð síanna.[18]Hálfsíu var rúllað, með efri hliðina inn á við,í 5 ml pólýprópýlen rör, ásamt perlunum sem fylgja með í settinu.Frá upphaflega 1 ml af lýsisbuffer gátum við fengið um 400 ul af lausn, sem síðan var unnin eins og skilgreint var af stöðluðum samskiptareglum, sem leiddi til lokaútrennslis upp á 15 ul.Í kjölfarið voru 5 ul notuð fyrir SARS-CoV-2 prófið.Í ljósi tiltekins uppruna sýnisins var qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix notað.[19]Mögnunarkerfin voru þau í samskiptareglunni sem þróað var af Corman o.fl., birt á vefsíðu WHO [20].
Prófið var beinlínis ætlað að staðfesta eða útiloka tilvist SARS-CoV-2 RNA á svifryki.Fyrsta greiningin notaði „E genið“ sem sameindamerki og gaf glæsilega jákvæða niðurstöðu á 15 af 16 síum, jafnvel þó, eins og við mátti búast, Ct væri á bilinu 36-38 lotur.
Eftir það höfum við endurtekið greininguna á 6 af jákvæðu síunum (þegar jákvæðar fyrir „E gen“) með því að nota „RtDR genið“ sem sameindamerki - sem er mjög sértækt fyrir SARS-CoV-2 - og náðum 5 marktækum niðurstöðum af jákvæðni;samanburðarpróf til að útiloka falska jákvæðni voru einnig gerðar með góðum árangri (mynd 1).
Til að koma í veg fyrir að fátækt sýnatökuefni sem var tiltækt kláraðist, voru eftirstöðvar útdregna RNA sendar á háskólasjúkrahúsið á staðnum (einni af klínísku miðstöðvunum sem ítalska ríkisstjórnin hefur leyfi til að gera SARS-CoV-2 greiningarpróf), til að framkvæma annað samhliða blindpróf.Þessi önnur klíníska rannsóknarstofa prófaði 34 RNA útdrætti fyrir E, N og RdRP genin, sem greindi frá 7 jákvæðum niðurstöðum fyrir að minnsta kosti eitt af þremur merki genum, með jákvæðni sérstaklega staðfest fyrir öll þrjú merki (Mynd 2).Vegna eðlis sýnisins og með hliðsjón af því að sýnatakan hefur ekki verið gerð í klínískum greiningartilgangi heldur til umhverfismengunarprófa (að teknu tilliti til þess að síur voru geymdar í að minnsta kosti fjórar vikur áður en þær fóru í sameindaerfðagreiningar, eins ogafleiðing af lokun Ítalíu), getum við staðfest að við höfum sanngjarnt sýnt fram á tilvist SARS-CoV-2 veiru-RNA með því að greina mjög sértækt „RtDR gen“ á 8 síum.Hins vegar, vegna skorts á viðbótarefnum úr síunum, gátum við ekki endurtekið nógu marga prófana til að sýna jákvæðni fyrir öll 3 sameindamerkin samtímis.
Þetta er fyrsta bráðabirgðasönnun þess að SARS-CoV-2 RNA geti verið til staðar á svifryki utandyra og bendir því til þess að við aðstæður þar sem lofthjúpurinn er stöðugur og mikill styrkur PM gæti SARS-CoV-2 myndað klasa með PM utandyra og – með því að draga úr útbreiðslustuðli þeirra - auka viðvarandi vírus í andrúmsloftinu.Frekari staðfestingar á þessari bráðabirgðatölusönnunargögn eru í gangi og ættu að fela í sér rauntímamat á lífsþrótti SARS-CoV-2 sem og meinvirkni þess þegar það aðsogast á svifryk.Sem stendur er ekki hægt að gera neinar forsendur um fylgni milli nærveru vírusins ​​​​við PM og framvindu COVID-19 faraldursins.Önnur atriði sem þarf að taka sérstaklega á eru meðalstyrkur PM að lokumnauðsynlegt vegna hugsanlegra „uppörvunaráhrifa“ smitsins (ef staðfest er að PM gæti virkað sem „beri“ fyrir veirudropakjarna), eða jafnvel fræðilegan möguleika á bólusetningu vegna lágmarks skammtaútsetningar við lægri þröskuld PM .

Mynd.1 Mögnunarferlar E (A) og RdRP gena (B): grænar línur tákna prófaðar síur;krossa línurtáknar viðmiðunarsíuútdrátt;rauðar línur tákna mögnun jákvæðu sýnanna.
Mynd.1

Mynd.2.Jákvæðar niðurstöður (merktar með X) fyrir E, N og RdRP gen fengnar fyrir öll 34 PM10 sýninsíur prófaðar í seinni samhliða greiningunum.
Mynd.2Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelliani8, A9andro
1. Iðnaðarefnafræðideild, Háskólinn í Bologna, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Ítalíu
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Þverdeildamiðstöð iðnaðarrannsókna „Renewable Sources, Environment, Blue Growth, Energy“,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Líffræðideild, „Aldo Moro“ háskóla í Bari, Bari, Ítalíu
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Efna- og lyfjavísindadeild háskólans í Trieste, Trieste, Ítalíu
e-mail: barbierp@units.it
5. Umhverfisrannsóknadeild, TCR TECORA, Mílanó, Ítalíu
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Lífvísindadeild – Háskólinn í Trieste, Trieste, Ítalíu
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Deild rannsóknarstofulækninga, háskólasjúkrahús Giuliano Isontina (ASU GI), Trieste, Ítalíu
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Ítalska umhverfislæknafélagið (SIMA), Mílanó, Ítalíu
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Deild umhverfisvísinda og umhverfisvísinda, háskólans í Mílanó, Mílanó, Ítalíu
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Samsvarandi höfundur:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it

Heimildir
1. Alþjóðaheilbrigðismálastofnunin, Smitleiðir vírusa sem valda COVID-19: afleiðingar fyrir ráðleggingar IPC um varúðarráðstafanir, vísindaleg samantekt;fáanlegt á: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29. mars 2020)
2. Ítalska heilbrigðisráðuneytið, daglegt fréttarit Covid-19 braust út á Ítalíu, fáanlegt á http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, European Environmental Agency, Air Quality in Europe 2019 skýrsla;nr 10/2019;Umhverfisstofnun Evrópu: Kaupmannahöfn, Danmörk, fáanleg á: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Útsetning fyrir loftmengun og COVID-19 dánartíðni í Bandaríkjunum, fáanleg á: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Ítalska umhverfislæknafélagið (SIMA), afstöðuskýrsla svifryks og COVID-19,
fáanlegt á: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Er það trúlegt hlutverk fyrir svifryk í útbreiðslu COVID-19 á Norður-Ítalíu?, BMJ Rapid Responses, 8. apríl 2020, fáanlegt á: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Myndun fuglainflúensuveiru (AIV) mengaðs saurfíns svifryks (PM2.5): uppgötvun erfðamengis og sýkingar og útreikningur á sýkingu.Dýralækningar örverufræði.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Smit í lofti gæti hafa átt þátt í útbreiðslu 2015 mjög sjúkdómsvaldandi fuglainflúensufaralda í Bandaríkin.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Mat á áhrifum rykatburða á tíðni mislinga í vesturhluta Kína.Andrúmsloft.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Samþætt líkan til að spá fyrir um útbreiðslu gin- og klaufaveikiveiru Epidemiol í andrúmslofti.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. New Directions: Airborne Transmission of Gin-and-Mouth Disease Virus Atmospheric Environment, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Útfellingarhraði veira og baktería fyrir ofan landamæralag andrúmsloftsins.ISME tímaritið.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H. ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Lengdarkönnun á örveru sem tengist svifryki í stórborg.Erfðamengi líffræði.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Sending í lofti gæti haft
átt þátt í útbreiðslu 2015 mjög sjúkdómsvaldandi fuglaflensufaraldra í Bandaríkjunum.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Mat á áhrifum rykatburða á tíðni mislinga í vesturhluta Kína.Andrúmsloft.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J.,Lang, J., Tian, ​​G., Jiang, J., Zhu, TF Bjartsýni DNA útdráttur og metagenomic raðgreining á örverusamfélögum í lofti .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Söfnun, kornastærð og uppgötvun loftbornra vírusa.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, vörulýsing, fáanleg á: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, lýsing á vörunni, fáanleg á: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, ​​R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Greining á 2019 nýrri kransæðaveiru (2019-nCoV) með rauntíma RT-PCR.Eurosurveillance, 25(3), fáanlegt á:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/

Upprunalegt: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995


Birtingartími: 18. apríl 2020