Poznato je da se teški akutni respiratorni sindrom poznat kao bolest COVID-19 – uzrokovan virusom SARS-CoV-2 – širi kapljičnim putem i bliskim kontaktom.[1]Teret COVID-19 bio je iznimno težak u Lombardiji i Padskoj dolini (sjeverna Italija),[2] području koje karakteriziraju visoke koncentracije čestica, za koje se već zna da imaju negativne učinke na ljudsko zdravlje.[3]Regionalne brojke dostupne za Italiju na dan 12. travnja pokazuju da oko 30% trenutno pozitivnih ljudi još uvijek živi u Lombardiji (oko 40% ako se uzme u obzir ukupan broj slučajeva potvrđenih od početka epidemije), a slijedi Emilia Romagna (13,5%) , Pijemont (10,5%) i Veneto (10%).[2]Ove četiri regije Padske nizine odgovorne su za 80% ukupnih smrtnih slučajeva zabilježenih u Italiji i 65% prijema u Jedinice intenzivne njege.[2]
Čini se da istraživanje koje je provela Harvard School of Public Health potvrđuje povezanost između povećanja koncentracija čestica čestica i stope smrtnosti od COVID-19 u SAD-u[4] U prethodnim komunikacijama, pretpostavili smo mogućnost da SARS-CoV-2 virus bi mogao biti prisutan na česticama (PM) tijekom širenja infekcije,[5,6] što je već dokazano
dostupno za druge viruse.[7-15] Međutim, pitanje mikrobioma povezanih s česticama u zraku, posebno u urbanim sredinama, i dalje je uvelike nedovoljno istraženo, [16] i – trenutno – nitko još nije proveo eksperimentalne studije koje su posebno usmjerene na pri potvrđivanju ili isključivanju prisutnosti SARS-CoV-2 na PM.
Ovdje predstavljamo prve rezultate analiza koje smo proveli na 34 uzorka PM10 PM10 na otvorenom/u zraku s industrijskog mjesta u provinciji Bergamo, prikupljenih s dva različita uzorkivača zraka tijekom neprekidnog razdoblja od 3 tjedna, od 21. veljače do ožujka 13.
Slijedeći metodologiju koju su opisali Pan et al.u 2019. (za prikupljanje, određivanje veličine čestica i otkrivanje virusa koji se prenose zrakom),[17] uzorci PM-a prikupljeni su na filtrima od kvarcnih vlakana pomoću gravimetrijskog uzorkivača zraka niske zapremine (38,3 l/min tijekom 23 sata), u skladu s referentnom metodom EN12341 :2014 za praćenje PM10.Čestice su zarobljene na filtrima s tipičnim 99,9%.zadržavanje aerosola, pravilno uskladišteno i dostavljeno u laboratorij za primijenjenu i komparativnu genomiku Sveučilišta u Trstu.S obzirom na "okolišnu" prirodu uzorka, vjerojatno bogatog inhibitorima DNA polimeraze, nastavili smo s ekstrakcijom RNA korištenjem pribora Quick RNA fecal soil microbe kit prilagođenog tipu filtara.[18]Pola filtra smotano je s gornjom stranom prema unutra,u polipropilenskoj tubi od 5 ml, zajedno s kuglicama koje se nalaze u kompletu.Od početnog 1 ml pufera za lizu, uspjeli smo dobiti oko 400 ul otopine, koja je zatim obrađena kako je definirano standardnim protokolima, što je rezultiralo konačnim eluatom od 15 ul.Nakon toga, 5 ul je korišteno za testiranje na SARS-CoV-2.S obzirom na određeno podrijetlo uzorka, korišten je qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Sustavi pojačanja bili su oni iz protokola koji su razvili Corman i suradnici, a objavljen je na web stranici SZO [20].
Test je bio izričito usmjeren na potvrđivanje ili isključivanje prisutnosti SARS-CoV-2 RNK na česticama.Prva analiza koristila je "E gen" kao molekularni marker i dala je impresivan pozitivan rezultat na 15 od 16 filtara čak i ako je, kao što smo mogli očekivati, Ct bio između 36-38 ciklusa.
Nakon toga, replicirali smo analizu na 6 pozitivnih filtera (već pozitivnih na "E gen") korištenjem "RtDR gena" kao molekularnog markera - koji je vrlo specifičan za SARS-CoV-2 - dosegnuvši 5 značajnih rezultata pozitivnosti;uspješno su provedeni i kontrolni testovi za isključivanje lažne pozitivnosti (slika 1).
Kako bi se izbjeglo ponestajanje oskudnog dostupnog materijala za uzorkovanje, preostale ekstrahirane RNA dostavljene su u lokalnu Sveučilišnu bolnicu (jedan od kliničkih centara koje je talijanska vlada ovlastila za dijagnostičke testove SARS-CoV-2), kako bi se izvršio drugi paralelni slijepi test.Ovaj drugi klinički laboratorij testirao je 34 ekstrakcije RNK za E, N i RdRP gene, izvijestivši o 7 pozitivnih rezultata za najmanje jedan od tri markerska gena, s odvojeno potvrđenom pozitivnošću za sva tri markera (slika 2).Zbog prirode uzorka i uzimajući u obzir da uzorkovanje nije provedeno u kliničku dijagnostičku svrhu, već za ispitivanja onečišćenja okoliša (također uzimajući u obzir da su filtri pohranjeni najmanje četiri tjedna prije podvrgavanja molekularno-genetičkim analizama, kaoposljedica talijanskog zatvaranja), možemo potvrditi da smo razumno dokazali prisutnost SARS-CoV-2 virusne RNK otkrivanjem vrlo specifičnog "RtDR gena" na 8 filtera.Međutim, zbog nedostatka dodatnih materijala iz filtara, nismo bili u mogućnosti ponoviti dovoljan broj testova da pokažemo pozitivnost za sva 3 molekularna markera istovremeno.
Ovo je prvi preliminarni dokaz da SARS-CoV-2 RNA može biti prisutan na vanjskim česticama, što sugerira da bi, u uvjetima atmosferske stabilnosti i visokih koncentracija PM-a, SARS-CoV-2 mogao stvoriti klastere s vanjskim PM-ovima i – smanjujući njihov koeficijent difuzije – povećavaju postojanost virusa u atmosferi.Daljnje potvrde ovog preliminarnogdokazi su u tijeku i trebali bi uključivati procjenu vitalnosti SARS-CoV-2 u stvarnom vremenu, kao i njegove virulencije kada se adsorbira na česticama.Trenutačno se ne mogu napraviti nikakve pretpostavke o korelaciji između prisutnosti virusa na PM-u i napredovanja epidemije COVID-19.Ostala pitanja koja treba posebno riješiti su prosječne koncentracije PM na krajupotreban za potencijalni "učinak pojačanja" zaraze (u slučaju da se potvrdi da bi PM mogao djelovati kao "prijenosnik" za jezgre virusnih kapljica), ili čak teoretsku mogućnost imunizacije kao posljedicu izlaganja minimalnoj dozi pri nižim pragovima PM-a .
Slika 1 Krivulje amplifikacije E (A) i RdRP gena (B): zelene linije predstavljaju testirane filtre;križne linijepredstavlja ekstrakcije referentnog filtra;crvene linije predstavljaju pojačanje pozitivnih uzoraka.
sl.2.Pozitivni rezultati (označeni s X) za E, N i RdRP gene dobiveni za sva 34 uzorka PM10filtri testirani u drugoj paralelnoj analizi.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, Alessandro Miani8,9
1. Zavod za industrijsku kemiju, Sveučilište u Bologni, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italija
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Međuodjelski centar za industrijska istraživanja “Obnovljivi izvori, okoliš, plavi rast, energija”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Odjel za biologiju, Sveučilište “Aldo Moro” u Bariju, Bari, Italija
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Katedra za kemijske i farmaceutske znanosti, Sveučilište u Trstu, Trst, Italija
e-mail: barbierp@units.it
5. Odjel za istraživanje okoliša, TCR TECORA, Milano, Italija
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Dept. of Life Sciences – Sveučilište u Trstu, Trst, Italija
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Odjel za laboratorijsku medicinu, Sveučilišna bolnica Giuliano Isontina (ASU GI), Trst, Italija
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Talijansko društvo za medicinu okoliša (SIMA), Milano, Italija
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Odjel za znanost i politiku okoliša, Sveučilište u Milanu, Milano, Italija
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Odgovarajući autor:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Reference
1. Svjetska zdravstvena organizacija, Načini prijenosa virusa koji uzrokuje COVID-19: implikacije za IPC preporuke za mjere opreza, Znanstveni sažetak;dostupno na: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29. ožujka 2020.)
2. Talijansko Ministarstvo zdravstva, dnevni bilten o izbijanju Covid-19 u Italiji, dostupno na http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Europska agencija za okoliš, Izvješće o kvaliteti zraka u Europi 2019.;br. 10/2019;Europska agencija za okoliš: Kopenhagen, Danska, dostupno na: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Izloženost zagađenju zraka i smrtnost od COVID-19 u Sjedinjenim Državama, dostupno na: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Talijansko društvo za medicinu zaštite okoliša (SIMA), Dokument o položaju čestica i COVID-19,
dostupno na: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Postoji li vjerojatna uloga za čestice u širenju COVID-19 u sjevernoj Italiji?, BMJ Rapid Responses, 8. travnja 2020., dostupno na: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Stvaranje fekalnih finih čestica (PM2,5) kontaminiranih virusom ptičje influence (AIV): otkrivanje genoma i infektivnosti te izračun imisije.Veterinarska mikrobiologija.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Prijenos zrakom mogao je igrati ulogu u širenju izbijanja visokopatogene influence ptica u 2015. Ujedinjene države.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019.)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Procjena utjecaja prašine na incidenciju ospica u zapadnoj Kini.Atmosferski okoliš.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Integrirani model za predviđanje atmosferskog širenja virusa slinavke i šapa Epidemiol.Infect., 124, 577–590 (2000.)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Nove smjernice: prijenos virusa slinavke i šapa zrakom u atmosferskom okruženju, 38 (3), 503-505 (2004.)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Stope taloženja virusa i bakterija iznad atmosferskog graničnog sloja.Časopis ISME.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Longitudinalno istraživanje mikrobioma povezanog s česticama u megagradu.Biologija genoma.21, 55 (2020.)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Prijenos zrakom može imati
odigrao je ulogu u širenju epidemije visokopatogene ptičje gripe u Sjedinjenim Državama 2015.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Procjena utjecaja prašine na incidenciju ospica u zapadnoj Kini.Atmosferski okoliš.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Optimizirana ekstrakcija DNK i metagenomsko sekvenciranje mikrobnih zajednica u zraku .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Skupljanje, određivanje veličine čestica i otkrivanje virusa koji se prenose zrakom.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, opis proizvoda, dostupan na: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, opis proizvoda, dostupan na: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, i Mulders, DG (2020.).
Otkrivanje novog koronavirusa 2019 (2019-nCoV) RT-PCR-om u stvarnom vremenu.Eurosurveillance, 25(3), dostupno na:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Izvornik: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Vrijeme objave: 18. travnja 2020