SARS-Cov-2 RNA löydettiin hiukkasista Bergamosta Pohjois-Italiassa: ensimmäinen alustava todiste

SARS-CoV-2-viruksen aiheuttaman vakavan akuutin hengitystieoireyhtymän, joka tunnetaan nimellä COVID-19-tauti, tiedetään leviävän hengityspisaroiden ja lähikontaktien välityksellä.[1]COVID-19:n aiheuttama taakka oli äärimmäisen vakava Lombardiassa ja Po-laaksossa (Pohjois-Italiassa),[2] alueella, jolle on ominaista korkeat hiukkaspitoisuudet, joilla tiedetään jo olevan kielteisiä vaikutuksia ihmisten terveyteen.[3]Italiasta 12. huhtikuuta saatavilla olevat alueelliset luvut osoittavat, että noin 30 % tällä hetkellä positiivisista ihmisistä asuu edelleen Lombardiassa (noin 40 %, jos otetaan huomioon epidemian alusta lähtien vahvistettujen tapausten kokonaismäärä), ja seuraavaksi tulee Emilia Romagna (13,5 %). , Piedmont (10,5 %) ja Veneto (10 %).[2]Nämä neljä Po-laakson aluetta vastaavat 80 % kaikista Italiassa kirjatuista kuolemista ja 65 % tehohoitoyksiköistä.[2]

Harvard School of Public Healthin tekemä tutkimus näyttää vahvistavan yhteyden hiukkaspitoisuuksien nousun ja COVID-19:n aiheuttaman kuolleisuuden välillä Yhdysvalloissa[4] Aiemmissa tiedonannoissamme olemme olettaneet mahdollisuutta, että SARS-CoV-2 virus saattaa olla läsnä hiukkasissa (PM) tartunnan leviämisen aikana,[5,6] johdonmukaisesti jo todisteiden kanssa
saatavilla muille viruksille.[7-15] Ilmassa leviävän PM:ään liittyvän mikrobiomin ongelma, erityisesti kaupunkiympäristössä, on kuitenkin edelleen suurelta osin alitutkittua[16], ja – toistaiseksi – kukaan ei ole vielä tehnyt kokeellisia tutkimuksia, joiden tarkoituksena on erityisesti vahvistaa tai sulkea pois SARS-CoV-2:n läsnäolon PM:ssä.
Tässä esittelemme ensimmäiset tulokset analyyseistä, jotka olemme tehneet 34 PM10-näytteelle ulko/ilman PM10-hiukkasista Bergamon maakunnan teollisuusalueelta, jotka on kerätty kahdella eri ilmanäytteenottimella jatkuvan 3 viikon aikana, 21. helmikuuta - maaliskuuta. 13.
Noudattamalla Pan et ai.vuonna 2019 (ilmassa leviävien virusten keräämistä, hiukkasten mitoitusta ja havaitsemista varten)[17] PM-näytteet kerättiin kvartsikuitusuodattimille käyttämällä pienitilavuuksista gravimetristä ilmanäytteenottolaitetta (38,3 l/min 23 tunnin ajan), joka on vertailumenetelmän EN12341 mukainen. :2014 PM10-seurantaan.Hiukkaset jäivät loukkuun suodattimiin 99,9 %:lla tyypillisestiaerosoliretentio, asianmukaisesti säilytettynä ja toimitettuna Triesten yliopiston soveltavan ja vertailevan genomiikan laboratorioon.Ottaen huomioon näytteen "ympäristö" luonteen, oletettavasti runsaasti DNA-polymeraasien estäjiä, eteni RNA:n uuttamiseen käyttämällä Quick RNA:n ulostemaamikrobisarjaa, joka on sovitettu suodattimien tyyppiin.[18]Puolisuodatin rullattiin yläpuoli sisäänpäin,5 ml:n polypropeeniputkessa yhdessä sarjaan kuuluvien helmien kanssa.Alkuperäisestä 1 ml:sta lyysipuskuria pystyimme saamaan noin 400 ui liuosta, joka sitten prosessoitiin standardiprotokollan mukaisesti, jolloin lopullinen eluaatti oli 15 ul.Myöhemmin SARS-CoV-2-testaukseen käytettiin 5 ul:ta.Ottaen huomioon näytteen erityisen alkuperän käytettiin qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMixiä.[19]Vahvistusjärjestelmät olivat Cormanin ja muiden WHO:n verkkosivuilla julkaistun protokollan mukaisia ​​[20].
Testin tarkoituksena oli nimenomaisesti vahvistaa tai sulkea pois SARS-CoV-2 RNA:n läsnäolo hiukkasmaisissa aineissa.Ensimmäisessä analyysissä käytettiin "E-geeniä" molekyylimarkkerina ja se tuotti vaikuttavan positiivisen tuloksen 15 suodattimella 16:sta, vaikka, kuten odotimme, Ct oli 36-38 syklin välillä.
Sen jälkeen olemme toistaneet analyysin 6 positiivisella suodattimella (jo positiivinen "E-geenille") käyttämällä "RtDR-geeniä" molekyylimarkkerina - joka on erittäin spesifinen SARS-CoV-2:lle - saavuttaen 5 merkittävää tulosta. positiivisuudesta;myös kontrollitestit väärän positiivisuuden poissulkemiseksi suoritettiin onnistuneesti (kuvio 1).
Jotta vältytään niukan näytteenottomateriaalin loppumisesta, jäljellä olevat uutetut RNA:t toimitettiin paikalliseen yliopistolliseen sairaalaan (yksi Italian hallituksen valtuuttamista SARS-CoV-2-diagnostisiin testeihin) toisen kerran. rinnakkaissokea testi.Tämä toinen kliininen laboratorio testasi 34 RNA-uuttoa E-, N- ja RdRP-geeneille ja raportoi 7 positiivista tulosta ainakin yhdelle kolmesta markkerigeenistä, ja positiivisuus vahvistettiin erikseen kaikille kolmelle markkerille (kuvio 2).Näytteen luonteesta johtuen ja kun otetaan huomioon, että näytteenottoa ei ole tehty kliinisiä diagnostisia tarkoituksia varten, vaan ympäristön saastetestejä varten (ottaen huomioon myös, että suodattimia on säilytetty vähintään neljä viikkoa ennen molekyyligeneettisiä analyysejä, kutenItalian sulkemisen seurauksena), voimme vahvistaa, että olemme osoittaneet kohtuudella SARS-CoV-2-viruksen RNA:n läsnäolon havaitsemalla erittäin spesifisen "RtDR-geenin" 8 suodattimella.Suodattimien lisämateriaalien puutteen vuoksi emme kuitenkaan pystyneet toistamaan riittävää määrää testejä osoittaaksemme positiivisuuden kaikille kolmelle molekyylimarkkerille samanaikaisesti.
Tämä on ensimmäinen alustava näyttö siitä, että SARS-CoV-2 RNA:ta voi esiintyä ulkona olevissa hiukkasaineissa, mikä viittaa siihen, että ilmakehän vakauden olosuhteissa ja korkeissa hiukkaspitoisuuksissa SARS-CoV-2 voisi luoda klustereita ulkoilman hiukkasten kanssa ja – vähentää niiden diffuusiokerrointa – parantaa viruksen pysyvyyttä ilmakehässä.Lisävahvistuksia tälle alustavalletodisteet ovat käynnissä, ja niiden pitäisi sisältää reaaliaikainen arviointi SARS-CoV-2:n elinvoimaisuudesta sekä sen virulenssista, kun se adsorboituu hiukkasiin.Tällä hetkellä ei voida tehdä oletuksia korrelaatiosta viruksen esiintymisen PM:ssä ja COVID-19-epidemian etenemisen välillä.Muita erityisesti käsiteltävänä olevia kysymyksiä ovat lopulta hiukkasten keskimääräiset pitoisuudettarvitaan tartunnan mahdolliseen "tehostevaikutukseen" (jos varmistetaan, että PM saattaa toimia "kantajana" viruksen pisaraytimille), tai jopa teoreettinen mahdollisuus immunisaatioon, joka johtuu minimaalisista PM-altistumisista alemmilla PM-kynnyksillä .

Kuva 1 E (A)- ja RdRP-geenien (B) monistuskäyrät: vihreät viivat edustavat testattuja suodattimia;poikkiviivatedustaa referenssisuodattimien poistoa;punaiset viivat edustavat positiivisten näytteiden vahvistusta.
Kuva 1

Kuva 2.Positiiviset tulokset (merkitty X:llä) E-, N- ja RdRP-geeneille, jotka saatiin kaikista 34 PM10-näytteestätoisessa rinnakkaisanalyysissä testatut suodattimet.
Kuva 2Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco A,9 Piscitelli8,8
1. Dept. Industrial Chemistry, Bolognan yliopisto, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italia
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Teollisuuden tutkimuslaitosten välinen keskus "Uusiutuvat lähteet, ympäristö, sininen kasvu, energia",
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Biologian laitos, Aldo Moron yliopisto, Bari, Bari, Italia
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Kemian ja farmaseuttisten tieteiden laitos, Triesten yliopisto, Trieste, Italia
e-mail: barbierp@units.it
5. Environmental Research Division, TCR TECORA, Milano, Italia
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Biotieteiden laitos – Triesten yliopisto, Trieste, Italia
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Laboratoriolääketieteen osasto, Giuliano Isontinan yliopistollinen sairaala (ASU GI), Trieste, Italia
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), Milano, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Ympäristötieteen ja Poicyn laitos, Milanon yliopisto, Milano, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Vastaava kirjoittaja:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it

Viitteet
1. Maailman terveysjärjestö, COVID-19:n aiheuttavan viruksen tarttumistavat: vaikutukset IPC:n varotoimisuosituksiin, Tieteellinen katsaus;saatavilla osoitteessa: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29. maaliskuuta 2020)
2. Italian terveysministeriö, päivittäinen tiedote Covid-19-epidemiasta Italiassa, saatavilla osoitteessa http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Euroopan ympäristökeskus, Ilmanlaatu Euroopassa 2019 -raportti;nro 10/2019;Euroopan ympäristökeskus: Kööpenhamina, Tanska, saatavilla osoitteessa: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Altistuminen ilmansaasteille ja COVID-19-kuolleisuus Yhdysvalloissa, saatavilla osoitteessa: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), Position Paper Particulate Matter ja COVID-19,
saatavilla osoitteessa: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Onko uskottava rooli hiukkasten osalta COVID-19:n leviämisessä Pohjois-Italiassa?, BMJ Rapid Responses, 8. huhtikuuta 2020, saatavilla osoitteessa: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generation of avian influenza virus (AIV) kontaminated fecal fine hiukkasmateriaali (PM2.5): genomin ja tarttuvuuden havaitseminen ja immission laskeminen.Eläinlääkintämikrobiologia.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Ilmassa tapahtuva tartunta on saattanut vaikuttaa vuoden 2015 erittäin patogeenisten lintuinfluenssaepidemioiden leviämiseen. Yhdysvallat.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Pölytapahtumien vaikutuksen arviointi tuhkarokkotapahtumiin Länsi-Kiinassa.Ilmakehän ympäristö.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Integroitu malli suu- ja sorkkatautiviruksen Epidemiol-viruksen ilmakehän leviämisen ennustamiseksi.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Uudet suunnat: Suu- ja sorkkatautiviruksen ilmakehän leviäminen ilmakehän ympäristössä, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Virusten ja bakteerien laskeutumisnopeudet ilmakehän rajakerroksen yläpuolella.ISME-lehti.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Pitkittäinen tutkimus hiukkasiin liittyvästä mikrobiomista megakaupungissa.Genomibiologia.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Ilmassa voi olla
vaikutti vuoden 2015 erittäin patogeenisen lintuinfluenssaepidemian leviämiseen Yhdysvalloissa.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Pölytapahtumien vaikutuksen arviointi tuhkarokkotapahtumiin Länsi-Kiinassa.Ilmakehän ympäristö.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, ​​G., Jiang, J., Zhu, TF Ilmassa olevien mikrobiyhteisöjen optimoitu DNA:n erottaminen ja metagenominen sekvensointi .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Ilmassa olevien virusten kerääminen, partikkelien koko ja havaitseminen.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, tuotekuvaus, saatavilla osoitteessa: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, tuotteen kuvaus, saatavilla osoitteessa: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, ​​R., Meijer, A., Chu, DK ja Mulders, DG (2020).
Vuoden 2019 uuden koronaviruksen (2019-nCoV) havaitseminen reaaliaikaisella RT-PCR:llä.Eurosurveillance, 25(3), saatavilla osoitteessa: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/

Alkuperäinen: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995


Postitusaika: 18.4.2020