Svært akut respiratorisk syndrom kendt som COVID-19 sygdom – på grund af SARS-CoV-2 virus – er kendt for at spredes via luftvejsdråber og tætte kontakter.[1]Byrden af COVID-19 var ekstremt alvorlig i Lombardiet og Po-dalen (det nordlige Italien),[2] et område præget af høje koncentrationer af partikler, som allerede er kendt for at have negative virkninger på menneskers sundhed.[3]Regionale tal tilgængelige for Italien på datoen den 12. april viser, at omkring 30 % af de i øjeblikket positive mennesker stadig bor i Lombardiet (ca. 40 %, hvis man tager de samlede tilfælde i betragtning, der er bekræftet fra begyndelsen af epidemien), efterfulgt af Emilia Romagna (13,5 %) , Piemonte (10,5%) og Veneto (10%).[2]Disse fire regioner i Po-dalen tegner sig for 80 % af de samlede dødsfald registreret i Italien og 65 % af indlæggelserne på intensivafdelinger.[2]
En forskning udført af Harvard School of Public Health ser ud til at bekræfte en sammenhæng mellem stigninger i PM-koncentrationer og dødelighedsrater på grund af COVID-19 i USA[4] I tidligere meddelelser har vi antaget muligheden for, at SARS-CoV-2 virus kan være til stede på partikler (PM) under spredningen af infektionen[5,6] i overensstemmelse med allerede beviser
Tilgængelig for andre vira.[7-15] Spørgsmålet om luftbåren PM-associeret mikrobiom, især i bymiljøer, er dog stadig stort set undersøgt,[16] og – på nuværende tidspunkt – har ingen stadig udført eksperimentelle undersøgelser specifikt rettet mod ved at bekræfte eller udelukke tilstedeværelsen af SARS-CoV-2 på PM.
Her præsenterer vi de første resultater af de analyser, vi har udført på 34 PM10-prøver af udendørs/luftbåren PM10 fra et industriområde i Bergamo-provinsen, indsamlet med to forskellige luftprøvetagere over en sammenhængende 3-ugers periode, fra 21. februar til marts 13.
Efter metoden beskrevet af Pan et al.i 2019 (til indsamling, partikelstørrelse og påvisning af luftbårne vira)[17] blev PM-prøver indsamlet på kvartsfiberfiltre ved at bruge en gravimetrisk luftprøveudtager med lav volumen (38,3 l/min i 23 timer), i overensstemmelse med referencemetoden EN12341 :2014 for PM10-overvågning.Partikler blev fanget på filtre med 99,9% typiskaerosolopbevaring, korrekt opbevaret og leveret til laboratoriet for anvendt og sammenlignende genomik ved Trieste Universitet.I betragtning af prøvens "miljømæssige" natur, formentlig rig på inhibitorer af DNA-polymeraser, fortsatte vi med ekstraktion af RNA ved at bruge Quick RNA fækal jord mikrobe kit tilpasset til typen af filtre.[18]Halvfilteret blev rullet, med oversiden vendt indad,i et 5 ml polypropylenrør sammen med perlerne i sættet.Fra den indledende 1 ml lysisbuffer var vi i stand til at få ca. 400 µl opløsning, som derefter blev behandlet som defineret af standardprotokollerne, hvilket resulterede i et endeligt eluat på 15 µl.Efterfølgende blev 5 ul brugt til SARS-CoV-2-testen.I betragtning af den særlige oprindelse af prøven blev qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix brugt.[19]Amplifikationssystemerne var dem i protokollen udviklet af Corman et al, offentliggjort på WHO's websted [20].
Testen var eksplicit rettet mod at bekræfte eller udelukke tilstedeværelsen af SARS-CoV-2 RNA på partikler.Den første analyse brugte "E-genet" som en molekylær markør og gav et imponerende positivt resultat på 15 ud af 16 filtre, selvom, som vi kunne forvente, Ct var mellem 36-38 cyklusser.
Derefter har vi replikeret analysen på 6 af de positive filtre (allerede positive til "E-genet") ved at bruge "RtDR-genet" som en molekylær markør - som er meget specifik for SARS-CoV-2 - og nåede 5 signifikante resultater af positivitet;kontroltests for at udelukke falsk positivitet blev også udført med succes (fig. 1).
For at undgå at løbe tør for det sparsomme prøvemateriale, der er tilgængeligt, blev de resterende ekstraherede RNA'er leveret til det lokale universitetshospital (et af de kliniske centre, der er godkendt af den italienske regering til SARS-CoV-2 diagnostiske tests), for at udføre en anden parallel blindtest.Dette andet kliniske laboratorium testede 34 RNA-ekstraktioner for E-, N- og RdRP-generne og rapporterede 7 positive resultater for mindst et af de tre markørgener, med positivitet separat bekræftet for alle de tre markører (fig. 2).På grund af prøvens beskaffenhed og i betragtning af, at prøveudtagningen ikke er blevet udført til klinisk diagnostiske formål, men til miljøforureningstests (der også tages i betragtning, at filtre blev opbevaret i mindst fire uger, før de undergik molekylærgenetiske analyser, somen konsekvens af den italienske nedlukning), kan vi bekræfte, at vi med rimelighed har påvist tilstedeværelsen af SARS-CoV-2 viralt RNA ved at detektere et meget specifikt "RtDR-gen" på 8 filtre.Men på grund af manglen på yderligere materialer fra filtrene var vi ikke i stand til at gentage et tilstrækkeligt antal tests til at vise positivitet for alle de 3 molekylære markører samtidigt.
Dette er det første foreløbige bevis på, at SARS-CoV-2 RNA kan være til stede på udendørs partikler, hvilket tyder på, at SARS-CoV-2 under forhold med atmosfærisk stabilitet og høje koncentrationer af PM kan skabe klynger med udendørs PM og – ved at reduktion af deres diffusionskoefficient – øger virusets persistens i atmosfæren.Yderligere bekræftelser af denne foreløbigebeviser er løbende og bør omfatte realtidsvurdering af SARS-CoV-2's vitalitet såvel som dets virulens, når det adsorberes på partikler.På nuværende tidspunkt kan der ikke foretages nogen antagelser om sammenhængen mellem tilstedeværelsen af virussen på PM og udviklingen af COVID-19-udbrud.Andre spørgsmål, der skal behandles specifikt, er de gennemsnitlige koncentrationer af partikler til sidstpåkrævet for en potentiel "boost-effekt" af smitten (i tilfælde af at det bekræftes, at PM kan fungere som en "bærer" for de virale dråbekerner), eller endda den teoretiske mulighed for immunisering som følge af minimal dosiseksponering ved lavere tærskler for PM .
Fig. 1 Amplifikationskurver for E (A) og RdRP gener (B): grønne linjer repræsenterer testede filtre;krydse linjerrepræsenterer referencefilterudtrækninger;røde linjer repræsenterer amplifikationen af de positive prøver.
Fig.2.Positive resultater (markeret med X) for E-, N- og RdRP-gener opnået for alle 34 PM10-prøvernefiltre testet i den anden parallelle analyser.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, A9andro
1. Afd. Industriel Kemi, Universitetet i Bologna, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italien
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Tværafdelingscenter for industriforskning "Vedvarende kilder, miljø, blå vækst, energi",
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Biologisk afdeling, Universitetet "Aldo Moro" i Bari, Bari, Italien
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Institut for Kemi og Farmaceutiske Videnskaber, Universitetet i Trieste, Trieste, Italien
e-mail: barbierp@units.it
5. Environmental Research Division, TCR TECORA, Milano, Italien
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Institut for Biovidenskab – Trieste Universitet, Trieste, Italien
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Afdeling for Laboratoriemedicin, Universitetshospitalet Giuliano Isontina (ASU GI), Trieste, Italien
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), Milano, Italien
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Institut for Miljøvidenskab og Poicy, Universitetet i Milano, Milano, Italien
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Kontaktforfatter:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Referencer
1. Verdenssundhedsorganisationen, Overførselsmåder af virus, der forårsager COVID-19: konsekvenser for IPC's forsigtighedsanbefalinger, videnskabelig brief;tilgængelig på: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29. marts 2020)
2. Det italienske sundhedsministerium, daglig bulletin Covid-19-udbrud i Italien, tilgængelig på http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, European Environmental Agency, Air Quality in Europe 2019-rapport;nr. 10/2019;Det Europæiske Miljøagentur: København, Danmark, tilgængelig på: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Eksponering for luftforurening og COVID-19-dødelighed i USA, tilgængelig på: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), Position Paper Particulate Matter og COVID-19,
tilgængelig på: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Er der en plausibel rolle for partikulært stof i spredningen af COVID-19 i det nordlige Italien?, BMJ Rapid Responses, 8. april 2020, tilgængelig på: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generering af aviær influenzavirus (AIV) kontamineret fækale fine partikler (PM2.5): genom- og infektivitetspåvisning og beregning af immission.Veterinær mikrobiologi.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Luftbåren transmission kan have spillet en rolle i spredningen af 2015 højpatogene aviær influenza-udbrud i Forenede Stater.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Vurdering for virkningen af støvhændelser på mæslingeforekomsten i det vestlige Kina.Atmosfærisk miljø.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI En integreret model til at forudsige den atmosfæriske spredning af mund- og klovsygevirus Epidemiol.Infect., 124, 577-590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Nye retninger: luftbåren transmission af mund- og klovsygevirus atmosfærisk miljø, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Afsætningshastigheder af vira og bakterier over det atmosperiske grænselag.ISME Journal.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H. ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Langsgående undersøgelse af mikrobiom forbundet med partikler i en megaby.Genom Biologi.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Luftbåren transmission kan have
spillet en rolle i spredningen af højpatogene fugleinfluenzaudbrud i 2015 i USA.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Vurdering for virkningen af støvhændelser på mæslingeforekomsten i det vestlige Kina.Atmosfærisk miljø.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Optimeret DNA-ekstraktion og metagenomisk sekventering af luftbårne mikrobielle samfund .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Indsamling, partikelstørrelse og påvisning af luftbårne vira.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, produktbeskrivelse, tilgængelig på: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, beskrivelse af produktet, tilgængelig på: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Påvisning af 2019 ny coronavirus (2019-nCoV) ved RT-PCR i realtid.Eurosurveillance, 25(3), tilgængelig på:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Original: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Indlægstid: 18-apr-2020