Teški akutni respiratorni sindrom poznat kao bolest COVID-19 – zbog virusa SARS-CoV-2 – prepoznato je da se širi respiratornim kapljicama i bliskim kontaktima.[1]Teret COVID-19 bio je izuzetno ozbiljan u Lombardiji i dolini Po (Sjeverna Italija),[2] području koje karakteriziraju visoke koncentracije čestica, za koje je već poznato da proizvode negativne efekte na ljudsko zdravlje.[3]Regionalne brojke dostupne za Italiju na dan 12. aprila pokazuju da oko 30% trenutno pozitivnih ljudi još uvijek živi u Lombardiji (oko 40% ako se uzme u obzir sveukupne slučajeve potvrđene od početka epidemije), a slijedi Emilia Romagna (13,5%) , Pijemont (10,5%) i Veneto (10%).[2]Ova četiri regiona Padske doline čine 80% ukupnih smrtnih slučajeva zabeleženih u Italiji i 65% primljenih u Jedinice intenzivne nege.[2]
Čini se da istraživanje koje je provela Harvardska škola javnog zdravlja potvrđuje povezanost između povećanja koncentracije PM i stopa smrtnosti zbog COVID-19 u SAD-u[4] U prethodnim komunikacijama, pretpostavili smo mogućnost da SARS-CoV-2 virus bi mogao biti prisutan na česticama (PM) tokom širenja infekcije,[5,6] u skladu sa već postojećim dokazima
dostupno za druge viruse.[7-15] Međutim, pitanje mikrobioma u zraku povezanog s PM, posebno u urbanim sredinama, ostaje u velikoj mjeri nedovoljno istraženo,[16] i – u ovom trenutku – još niko nije sproveo eksperimentalne studije sa posebnim ciljem. prilikom potvrđivanja ili isključivanja prisustva SARS-CoV-2 na PM.
Ovdje predstavljamo prve rezultate analiza koje smo izvršili na 34 uzorka PM10 PM10 na otvorenom/u zraku sa industrijskog mjesta u provinciji Bergamo, prikupljenih sa dva različita uzorkivača zraka u kontinuiranom periodu od 3 sedmice, od 21. februara do marta. 13.
Slijedeći metodologiju koju su opisali Pan et al.2019. godine (za sakupljanje, određivanje veličine čestica i detekciju virusa koji se prenose zrakom),[17] PM uzorci su prikupljeni na filterima od kvarcnih vlakana korištenjem gravimetrijskog uzorkivača zraka male zapremine (38,3 l/min 23 h), u skladu sa referentnom metodom EN12341 :2014 za praćenje PM10.Čestice su zarobljene na filterima sa tipičnim 99,9%.zadržavanje aerosola, propisno uskladišteno i dostavljeno u laboratoriju primijenjene i komparativne genomike Univerziteta u Trstu.S obzirom na „ekološko“ prirodu uzorka, vjerovatno bogatog inhibitorima DNK polimeraza, nastavili smo sa ekstrakcijom RNK korištenjem Quick RNA kompleta za fekalno tlo prilagođenog vrsti filtera.[18]Polovina filtera je umotana, sa gornjom stranom okrenutom prema unutra,u polipropilenskoj tubi od 5 ml, zajedno sa perlama koje se nalaze u kompletu.Od početnih 1 ml pufera za lizu, uspjeli smo dobiti oko 400 ul otopine, koja je zatim obrađena kako je definirano standardnim protokolima, što je rezultiralo konačnim eluatom od 15 ul.Nakon toga, 5 ul je korišteno za testiranje SARS-CoV-2.S obzirom na specifično porijeklo uzorka, korišten je qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Sistemi amplifikacije su oni iz protokola koji su razvili Corman et al, a koji je objavljen na web stranici SZO [20].
Test je eksplicitno imao za cilj da potvrdi ili isključi prisustvo SARS-CoV-2 RNK na česticama.Prva analiza koristila je “E gen” kao molekularni marker i dala impresivan pozitivan rezultat na 15 od 16 filtera čak i ako je, kao što smo mogli očekivati, Ct bio između 36-38 ciklusa.
Nakon toga, ponovili smo analizu na 6 pozitivnih filtera (već pozitivnih na “E gen”) koristeći “RtDR gen” kao molekularni marker – koji je vrlo specifičan za SARS-CoV-2 – postigavši 5 značajnih rezultata pozitivnosti;Uspješno su obavljeni i kontrolni testovi za isključivanje lažne pozitivnosti (slika 1).
Kako bi se izbjegao nestanak dostupnog oskudnog materijala za uzorkovanje, preostale ekstrahirane RNK su dostavljene u lokalnu Univerzitetsku bolnicu (jedan od kliničkih centara koje je talijanska vlada ovlastila za dijagnostičke testove SARS-CoV-2), kako bi se izvršila druga paralelni slijepi test.Ova druga klinička laboratorija testirala je 34 ekstrakcije RNK za E, N i RdRP gene, izvještavajući o 7 pozitivnih rezultata za najmanje jedan od tri markerska gena, pri čemu je pozitivnost odvojeno potvrđena za sva tri markera (slika 2).Zbog prirode uzorka, a uzimajući u obzir da uzorkovanje nije obavljeno u svrhu kliničke dijagnostike, već radi ispitivanja zagađenja životne sredine (uzimajući u obzir i da su filteri čuvani najmanje četiri nedelje pre podvrgavanja molekularno-genetskim analizama, tj.posljedica gašenja u Italiji), možemo potvrditi da smo razumno demonstrirali prisustvo virusne RNK SARS-CoV-2 detekcijom visoko specifičnog “RtDR gena” na 8 filtera.Međutim, zbog nedostatka dodatnih materijala iz filtera, nismo bili u mogućnosti da ponovimo dovoljan broj testova da pokažemo pozitivnost za sva 3 molekularna markera istovremeno.
Ovo je prvi preliminarni dokaz da SARS-CoV-2 RNA može biti prisutna na vanjskim česticama, što sugerira da bi, u uvjetima atmosferske stabilnosti i visokih koncentracija PM, SARS-CoV-2 mogao stvoriti klastere s vanjskim česticama i – smanjujući njihov koeficijent difuzije – povećavaju postojanost virusa u atmosferi.Daljnje potvrde ove preliminarnedokazi su u toku i trebali bi uključivati procjenu u realnom vremenu o vitalnosti SARS-CoV-2, kao i njegovoj virulenciji kada se adsorbira na čestice.Trenutno se ne mogu napraviti pretpostavke o korelaciji između prisustva virusa na PM i napredovanja epidemije COVID-19.Druga pitanja kojima se treba posebno pozabaviti su prosječne koncentracije PM na krajupotrebno za potencijalni "pojačavajući efekat" zaraze (u slučaju da se potvrdi da PM može djelovati kao "nosač" za jezgra virusnih kapljica), ili čak teoretska mogućnost imunizacije kao posljedica izloženosti minimalnim dozama na nižim pragovima PM .
Slika 1 Krive amplifikacije gena E (A) i RdRP (B): zelene linije predstavljaju testirane filtere;unakrsne linijepredstavlja ekstrakcije referentnog filtera;crvene linije predstavljaju pojačanje pozitivnih uzoraka.
Fig.2.Pozitivni rezultati (označeni sa X) za E, N i RdRP gene dobijeni za sva 34 uzorka PM10filteri testirani u drugoj paralelnoj analizi.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Piscitelli7, Prisco A.
1. Odsjek za industrijsku hemiju, Univerzitet u Bologni, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italija
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Interresorni centar za industrijska istraživanja “Obnovljivi izvori, životna sredina, plavi rast, energija”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Odsjek biologije, Univerzitet “Aldo Moro” u Bariju, Bari, Italija
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Odsjek za kemijske i farmaceutske nauke, Univerzitet u Trstu, Trst, Italija
e-mail: barbierp@units.it
5. Odsek za istraživanje životne sredine, TCR TECORA, Milano, Italija
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Odsjek prirodnih nauka – Univerzitet u Trstu, Trst, Italija
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Odjel za laboratorijsku medicinu, Univerzitetska bolnica Giuliano Isontina (ASU GI), Trst, Italija
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italijansko društvo za medicinu životne sredine (SIMA), Milano, Italija
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Odsjek za nauku o okolišu i politiku, Univerzitet u Milanu, Milano, Italija
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Autor za dopisivanje:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Reference
1. Svjetska zdravstvena organizacija, Načini prijenosa virusa koji uzrokuje COVID-19: implikacije na preporuke IPC-a o mjerama opreza, Naučni sažetak;dostupno na: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29. mart 2020.)
2. Ministarstvo zdravlja Italije, dnevni bilten Covid-19 izbijanje u Italiji, dostupno na http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Evropska agencija za životnu sredinu, Izvještaj o kvaliteti zraka u Evropi 2019.;br. 10/2019;Evropska agencija za životnu sredinu: Kopenhagen, Danska, dostupno na: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Izloženost zagađenju zraka i smrtnost od COVID-19 u Sjedinjenim Državama, dostupno na: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italijansko društvo za medicinu zaštite životne sredine (SIMA), pozicioniranje čestica čestica i COVID-19,
dostupno na: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Postoji li vjerodostojna uloga za čestice u širenju COVID-19 u sjevernoj Italiji?, BMJ Rapid Responses, 8. aprila 2020., dostupno na: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generacija fekalnih finih čestica kontaminiranih virusom ptičjeg gripa (AIV) (PM2.5): detekcija genoma i infektivnosti i izračunavanje imisije.Veterinary Microbiology.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Zračni prijenos je možda imao ulogu u širenju visoko patogene ptičje gripe u 2015. Sjedinjene Države.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Procjena uticaja pojave prašine na pojavu morbila u zapadnoj Kini.Atmosfersko okruženje.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Integrirani model za predviđanje atmosferskog širenja Epidemiol virusa slinavke i šapa.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. New Directions: Airborne Transmission of Eaf and Mouth Disease Virus Atmospheric Environment, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Stope depozicije virusa i bakterija iznad atmosferskog graničnog sloja.The ISME Journal.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Longitudinalno istraživanje mikrobioma povezanog sa česticama u megagradu.Genome Biology.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Airborne prijenos može imati
odigrao je ulogu u širenju visoko patogene ptičje gripe u Sjedinjenim Državama 2015.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Procjena uticaja pojave prašine na pojavu malih boginja u zapadnoj Kini.Atmosfersko okruženje.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J.,Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Optimizirana ekstrakcija DNK i metagenomsko sekvenciranje mikrobnih zajednica u zraku .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Sakupljanje, određivanje veličine čestica i detekcija virusa u vazduhu.Časopis za primijenjenu mikrobiologiju, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, opis proizvoda, dostupan na: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, opis proizvoda, dostupno na: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Detekcija novog koronavirusa iz 2019. (2019-nCoV) pomoću RT-PCR u realnom vremenu.Eurosurveillance, 25(3), dostupno na: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Original: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Vrijeme objave: Apr-18-2020