A síndrome respiratória aguda grave, conhecida como doença COVID-19 – causada pelo vírus SARS-CoV-2 – é reconhecida por se disseminar por meio de gotículas respiratórias e contato próximo.[1] A carga da COVID-19 foi extremamente severa na Lombardia e no Vale do Pó (norte da Itália),[2] uma área caracterizada por altas concentrações de material particulado, que já se sabe produzirem efeitos negativos na saúde humana.[3] Dados regionais disponíveis para a Itália em 12 de abril mostram que cerca de 30% das pessoas atualmente positivas ainda vivem na Lombardia (cerca de 40% se considerarmos o total de casos confirmados desde o início da epidemia), seguidas pela Emília-Romanha (13,5%), Piemonte (10,5%) e Vêneto (10%).[2] Essas quatro regiões do Vale do Pó representam 80% do total de mortes registradas na Itália e 65% das internações em Unidades de Terapia Intensiva.[2]
Uma pesquisa realizada pela Escola de Saúde Pública de Harvard parece confirmar uma associação entre o aumento das concentrações de MP e as taxas de mortalidade por COVID-19 nos EUA[4]. Em comunicações anteriores, levantamos a hipótese de que o vírus SARS-CoV-2 poderia estar presente em material particulado (MP) durante a disseminação da infecção[5,6], em consonância com evidências já existentes.
disponível para outros vírus.[7-15] No entanto, a questão do microbioma associado ao PM no ar, especialmente em ambientes urbanos, permanece amplamente subinvestigada,[16] e – até o momento – ninguém ainda realizou estudos experimentais especificamente voltados para confirmar ou excluir a presença do SARS-CoV-2 no PM.
Apresentamos aqui os primeiros resultados das análises que realizamos em 34 amostras de PM10 (partículas de 10% do ar) provenientes de um local industrial na província de Bergamo, coletadas com dois amostradores de ar diferentes durante um período contínuo de 3 semanas, de 21 de fevereiro a 13 de março.
Seguindo a metodologia descrita por Pan et al. em 2019 (para a coleta, dimensionamento de partículas e detecção de vírus aerotransportados),[17] as amostras de MP foram coletadas em filtros de fibra de quartzo utilizando um amostrador gravimétrico de ar de baixo volume (38,3 l/min por 23 h), em conformidade com o método de referência EN12341:2014 para monitoramento de MP10. O material particulado foi retido nos filtros com 99,9% de eficiência típica.retenção de aerossóis, devidamente armazenados e entregues ao laboratório de Genômica Aplicada e Comparativa da Universidade de Trieste. Dada a natureza “ambiental” da amostra, presumivelmente rica em inibidores de DNA polimerases, procedemos à extração de RNA utilizando o kit Quick RNA fecal soil microbe adaptado ao tipo de filtros.[18] Metade do filtro foi enrolada, com a face superior voltada para dentro,em um tubo de polipropileno de 5 ml, juntamente com as esferas fornecidas no kit. A partir do 1 ml inicial de tampão de lise, conseguimos obter cerca de 400 µl de solução, que foi então processada conforme definido pelos protocolos padrão, resultando em um eluato final de 15 µl. Posteriormente, 5 µl foram usados para o teste de SARS-CoV-2. Dada a origem específica da amostra, foi utilizado o qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19] Os sistemas de amplificação foram os do protocolo desenvolvido por Corman et al, publicado no site da OMS [20].
O teste visava explicitamente confirmar ou excluir a presença do RNA do SARS-CoV-2 em partículas. A primeira análise utilizou o “gene E” como marcador molecular e produziu um resultado positivo impressionante em 15 dos 16 filtros, mesmo que, como era de se esperar, o Ct estivesse entre 36 e 38 ciclos.
Em seguida, replicamos a análise em 6 dos filtros positivos (já positivos para o “gene E”) usando o “gene RtDR” como marcador molecular – que é altamente específico para SARS-CoV-2 – obtendo 5 resultados significativos de positividade; testes de controle para excluir falsos positivos também foram realizados com sucesso (Fig. 1).
Para evitar o esgotamento do escasso material de amostragem disponível, o RNA extraído restante foi enviado ao Hospital Universitário local (um dos centros clínicos autorizados pelo Governo Italiano para testes de diagnóstico de SARS-CoV-2), a fim de realizar um segundo teste cego paralelo. Este segundo laboratório clínico testou 34 extrações de RNA para os genes E, N e RdRP, relatando 7 resultados positivos para pelo menos um dos três genes marcadores, com positividade confirmada separadamente para todos os três marcadores (Fig. 2). Devido à natureza da amostra, e considerando que a coleta não foi realizada para fins de diagnóstico clínico, mas para testes de poluição ambiental (levando em conta também que os filtros foram armazenados por pelo menos quatro semanas antes de serem submetidos a análises genéticas moleculares, comoComo consequência do confinamento na Itália, podemos confirmar ter demonstrado, de forma razoável, a presença de RNA viral do SARS-CoV-2 pela detecção do gene altamente específico “RtDR” em 8 filtros. No entanto, devido à falta de material adicional dos filtros, não foi possível repetir um número suficiente de testes para demonstrar positividade para todos os 3 marcadores moleculares simultaneamente.
Esta é a primeira evidência preliminar de que o RNA do SARS-CoV-2 pode estar presente em partículas em suspensão no ar externo, sugerindo que, em condições de estabilidade atmosférica e altas concentrações de MP, o SARS-CoV-2 poderia formar aglomerados com essas partículas e, ao reduzir seu coeficiente de difusão, aumentar a persistência do vírus na atmosfera. Confirmações adicionais desta evidência preliminar são necessárias.As evidências estão em andamento e devem incluir avaliações em tempo real sobre a viabilidade do SARS-CoV-2, bem como sua virulência quando adsorvido em material particulado. No momento, não é possível fazer suposições sobre a correlação entre a presença do vírus em material particulado e a progressão do surto de COVID-19. Outras questões a serem abordadas especificamente são as concentrações médias de material particulado.necessário para um potencial "efeito de reforço" do contágio (caso se confirme que as PM podem atuar como "veículo" para os núcleos das gotículas virais), ou mesmo a possibilidade teórica de imunização consequente a exposições a doses mínimas em limiares mais baixos de PM.
Figura 1. Curvas de amplificação dos genes E (A) e RdRP (B): as linhas verdes representam os filtros testados; as linhas cruzadas representam os filtros testados.Representa as extrações do filtro de referência; as linhas vermelhas representam a amplificação das amostras positivas.
Figura 2. Resultados positivos (marcados com X) para os genes E, N e RdRP obtidos para todas as 34 amostras de PM10.Filtros testados na segunda análise paralela.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, Alessandro Miani8,9
1. Departamento de Química Industrial, Universidade de Bolonha, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bolonha, Itália
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Centro Interdepartamental de Pesquisa Industrial “Fontes Renováveis, Meio Ambiente, Crescimento Azul, Energia”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Departamento de Biologia, Universidade “Aldo Moro” de Bari, Bari, Itália
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Departamento de Ciências Químicas e Farmacêuticas, Universidade de Trieste, Trieste, Itália
e-mail: barbierp@units.it
5. Divisão de Pesquisa Ambiental, TCR TECORA, Milão, Itália
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Departamento de Ciências da Vida – Universidade de Trieste, Trieste, Itália
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Divisão de Medicina Laboratorial, Hospital Universitário Giuliano Isontina (ASU GI), Trieste, Itália
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Sociedade Italiana de Medicina Ambiental (SIMA), Milão, Itália
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Departamento de Ciências e Políticas Ambientais, Universidade de Milão, Milão, Itália
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Autor correspondente:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Referências
1. Organização Mundial da Saúde, Modos de transmissão do vírus causador da COVID-19: implicações para as recomendações de precaução de PCI, Resumo científico; disponível em: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 de março de 2020)
2. Ministério da Saúde da Itália, boletim diário sobre o surto de Covid-19 na Itália, disponível em http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Agência Europeia do Ambiente, Relatório sobre a Qualidade do Ar na Europa 2019; N.º 10/2019; Agência Europeia do Ambiente: Copenhaga, Dinamarca, disponível em: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Exposição à poluição do ar e mortalidade por COVID-19 nos Estados Unidos, disponível em: https://projects.iq.harvard.edu/files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Sociedade Italiana de Medicina Ambiental (SIMA), Documento de Posição sobre Material Particulado e COVID-19,
Disponível em: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Existe um papel plausível para material particulado na disseminação de COVID-19 no norte da Itália?, BMJ Rapid Responses, 8 de abril de 2020, disponível em: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Geração de partículas finas fecais (PM2,5) contaminadas com o vírus da influenza aviária (VIA): detecção do genoma e da infectividade e cálculo da imissão. Microbiologia Veterinária. 139, 156-164 (2009)
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18. Zymoresearch Ltd, descrição do produto, disponível em: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, descrição do produto, disponível em: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Detecção do novo coronavírus de 2019 (2019-nCoV) por RT-PCR em tempo real. Eurosurveillance, 25(3), disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Original: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Data da publicação: 18/04/2020
