Ciężki ostry zespół oddechowy znany jako choroba COVID-19 – wywołany wirusem SARS-CoV-2 – rozprzestrzenia się drogą kropelkową i przez bliskie kontakty.[1] Obciążenie COVID-19 było wyjątkowo poważne w Lombardii i Dolinie Padu (północne Włochy),[2] obszarze charakteryzującym się wysokim stężeniem cząstek stałych, o których wiadomo, że mają negatywny wpływ na zdrowie ludzi.[3] Dane regionalne dostępne dla Włoch na dzień 12 kwietnia pokazują, że około 30% obecnie pozytywnych osób nadal mieszka w Lombardii (około 40%, jeśli wziąć pod uwagę wszystkie przypadki potwierdzone od początku epidemii), a następnie w Emilii-Romanii (13,5%), Piemoncie (10,5%) i Wenecji Euganejskiej (10%).[2] Te cztery regiony Doliny Padu odpowiadają za 80% wszystkich zgonów odnotowanych we Włoszech i 65% przyjęć na oddziały intensywnej terapii.[2]
Badania przeprowadzone przez Harvard School of Public Health zdają się potwierdzać związek między wzrostem stężenia pyłu zawieszonego (PM) a wskaźnikami śmiertelności z powodu COVID-19 w USA[4]. W poprzednich komunikatach wysunęliśmy hipotezę, że wirus SARS-CoV-2 może być obecny na cząstkach stałych (PM) podczas rozprzestrzeniania się zakażenia[5,6], co jest zgodne z dowodami już przedstawionymi
dostępne dla innych wirusów.[7–15] Jednak kwestia mikrobiomu związanego z pyłem zawieszonym w powietrzu, zwłaszcza w środowiskach miejskich, pozostaje w dużej mierze niedostatecznie zbadana[16] i – jak dotąd – nikt nie przeprowadził jeszcze badań eksperymentalnych mających na celu potwierdzenie lub wykluczenie obecności wirusa SARS-CoV-2 na pyłach zawieszonych.
W niniejszym artykule przedstawiamy pierwsze wyniki analiz, które przeprowadziliśmy na 34 próbkach pyłu PM10 unoszącego się w powietrzu i pochodzącego z terenu przemysłowego prowincji Bergamo, pobranych za pomocą dwóch różnych próbników powietrza w okresie 3 tygodni od 21 lutego do 13 marca.
Zgodnie z metodologią opisaną przez Pan i in. w 2019 r. (dotyczącą zbierania, określania wielkości cząstek i wykrywania wirusów unoszących się w powietrzu) [17] próbki pyłu zawieszonego pobrano na filtrach z włókien kwarcowych przy użyciu grawimetrycznego próbnika powietrza o małej objętości (38,3 l/min przez 23 godz.), zgodnego z metodą referencyjną EN12341:2014 dla monitorowania pyłu PM10. Cząstki stałe zostały zatrzymane na filtrach z typowym 99,9%retencji aerozolu, odpowiednio przechowywany i dostarczony do laboratorium Genomiki Stosowanej i Porównawczej Uniwersytetu w Trieście. Biorąc pod uwagę „środowiskowy” charakter próbki, prawdopodobnie bogatej w inhibitory polimeraz DNA, przystąpiliśmy do ekstrakcji RNA za pomocą zestawu Quick RNA do analizy mikroorganizmów glebowych w kale, dostosowanego do rodzaju filtrów.[18] Połowa filtra została zwinięta, górną stroną skierowaną do wewnątrz,w 5 ml probówce polipropylenowej wraz z kulkami dostarczonymi w zestawie. Z początkowego 1 ml buforu lizy udało nam się uzyskać około 400 ul roztworu, który następnie przetworzono zgodnie ze standardowymi protokołami, uzyskując końcowy eluat 15 ul. Następnie 5 ul użyto do testu SARS-CoV-2. Ze względu na szczególne pochodzenie próbki, użyto qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19] Systemy amplifikacji były systemami protokołu opracowanego przez Cormana i in., opublikowanego na stronie internetowej WHO [20].
Test miał wyraźnie na celu potwierdzenie lub wykluczenie obecności RNA SARS-CoV-2 na cząstkach stałych. Pierwsza analiza wykorzystała „gen E” jako marker molekularny i dała imponujący wynik pozytywny na 15 z 16 filtrów, mimo że, jak można było się spodziewać, Ct wynosił między 36 a 38 cykli.
Następnie powtórzyliśmy analizę na 6 filtrach pozytywnych (już pozytywnych na „gen E”), używając „genu RtDR” jako markera molekularnego – który jest wysoce specyficzny dla SARS-CoV-2 – uzyskując 5 istotnych wyników pozytywnych; pomyślnie przeprowadzono również testy kontrolne w celu wykluczenia wyników fałszywie pozytywnych (ryc. 1).
Aby uniknąć wyczerpania się ograniczonego dostępnego materiału do pobierania próbek, pozostałe wyekstrahowane RNA dostarczono do lokalnego Szpitala Uniwersyteckiego (jednego z ośrodków klinicznych autoryzowanych przez rząd włoski do przeprowadzania testów diagnostycznych SARS-CoV-2) w celu wykonania drugiego równoległego ślepego testu. To drugie laboratorium kliniczne przetestowało 34 ekstrakcje RNA dla genów E, N i RdRP, zgłaszając 7 pozytywnych wyników dla co najmniej jednego z trzech genów markerowych, przy czym pozytywność potwierdzono oddzielnie dla wszystkich trzech markerów (ryc. 2). Ze względu na charakter próbki i biorąc pod uwagę, że pobieranie próbek nie zostało przeprowadzone w celach diagnostyki klinicznej, ale w celu przeprowadzenia testów zanieczyszczenia środowiska (biorąc również pod uwagę, że filtry były przechowywane przez co najmniej cztery tygodnie przed poddaniem ich molekularnym analizom genetycznym, ponieważW konsekwencji włoskiego zamknięcia możemy potwierdzić, że w sposób uzasadniony wykazaliśmy obecność RNA wirusa SARS-CoV-2, wykrywając wysoce specyficzny „gen RtDR” na 8 filtrach. Jednak z powodu braku dodatkowych materiałów z filtrów nie byliśmy w stanie powtórzyć wystarczającej liczby testów, aby wykazać pozytywny wynik dla wszystkich 3 markerów molekularnych jednocześnie.
Jest to pierwszy wstępny dowód na obecność RNA SARS-CoV-2 w cząstkach stałych na zewnątrz, co sugeruje, że w warunkach stabilności atmosfery i wysokich stężeń pyłu zawieszonego (PM), SARS-CoV-2 może tworzyć skupiska z pyłem zawieszonym na zewnątrz i – poprzez obniżenie ich współczynnika dyfuzji – zwiększać trwałość wirusa w atmosferze. Dalsze potwierdzenia tego wstępnegoBadania są w toku i powinny obejmować ocenę w czasie rzeczywistym żywotności wirusa SARS-CoV-2, a także jego zjadliwości po zaadsorbowaniu na cząstkach stałych. Obecnie nie można poczynić żadnych założeń dotyczących korelacji między obecnością wirusa na pyłach zawieszonych (PM) a rozwojem epidemii COVID-19. Inne kwestie, które należy szczegółowo omówić, to średnie stężenia pyłów zawieszonych (PM) w przyszłości.wymagane do potencjalnego „wzmocnienia efektu” zakażenia (w przypadku potwierdzenia, że PM może działać jako „nośnik” jąder kropelek wirusa) lub nawet teoretycznej możliwości uodpornienia w wyniku minimalnej ekspozycji na dawkę przy niższych progach PM.
Rys.1 Krzywe amplifikacji genów E (A) i RdRP (B): linie zielone oznaczają testowane filtry; linie krzyżoweprzedstawia ekstrakcje filtrów referencyjnych; czerwone linie przedstawiają amplifikację próbek dodatnich.
Rys. 2. Wyniki pozytywne (oznaczone X) dla genów E, N i RdRP uzyskane dla wszystkich 34 próbek PM10filtry testowane w drugiej analizie równoległej.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, Alessandro Miani8,9
1. Katedra Chemii Przemysłowej, Uniwersytet w Bolonii, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bolonia, Włochy
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Międzyresortowe Centrum Badań Przemysłowych „Źródła odnawialne, środowisko, wzrost niebieski, energia”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Wydział Biologii, Uniwersytet „Aldo Moro” w Bari, Bari, Włochy
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Wydział Nauk Chemicznych i Farmaceutycznych, Uniwersytet w Trieście, Triest, Włochy
e-mail: barbierp@units.it
5. Dział Badań Środowiskowych, TCR TECORA, Mediolan, Włochy
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Wydział Nauk Przyrodniczych – Uniwersytet w Trieście, Triest, Włochy
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Oddział Medycyny Laboratoryjnej, Szpital Uniwersytecki Giuliano Isontina (ASU GI), Triest, Włochy
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Włoskie Towarzystwo Medycyny Środowiskowej (SIMA), Mediolan, Włochy
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Wydział Nauk o Środowisku i Polityki, Uniwersytet w Mediolanie, Mediolan, Włochy
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Autor korespondencyjny:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Odniesienia
1. Światowa Organizacja Zdrowia, Sposoby transmisji wirusa powodującego COVID-19: implikacje dla zaleceń dotyczących środków ostrożności w ramach IPC, Raport naukowy; dostępny na stronie: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 marca 2020 r.)
2. Włoskie Ministerstwo Zdrowia, codzienny biuletyn „Wybuch epidemii COVID-19 we Włoszech”, dostępny na stronie http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Europejska Agencja Środowiska, Raport na temat jakości powietrza w Europie w 2019 r.; nr 10/2019; Europejska Agencja Środowiska: Kopenhaga, Dania, dostępny na stronie: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Narażenie na zanieczyszczenie powietrza a śmiertelność z powodu COVID-19 w Stanach Zjednoczonych, dostępne na stronie: https://projects.iq.harvard.edu/files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Włoskie Towarzystwo Medycyny Środowiskowej (SIMA), Dokument stanowiska: Cząstki stałe i COVID-19,
dostępne na stronie: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Czy istnieje prawdopodobna rola cząstek stałych w rozprzestrzenianiu się COVID-19 w północnych Włoszech?, BMJ Rapid Responses, 8 kwietnia 2020 r., dostępne pod adresem: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generowanie drobnych cząstek stałych (PM2,5) pochodzących z kału zanieczyszczonych wirusem grypy ptaków (AIV): wykrywanie genomu i zakaźności oraz obliczanie imisji. Veterinary Microbiology. 139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Transmisja drogą powietrzną mogła odegrać rolę w rozprzestrzenianiu się ognisk wysoce zjadliwej grypy ptaków w 2015 r. w Stanach Zjednoczonych. Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Ocena wpływu zdarzeń pyłowych na zachorowalność na odrę w zachodnich Chinach. Atmospheric Environment. 157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Zintegrowany model przewidywania rozprzestrzeniania się wirusa pryszczycy w atmosferze Epidemiol. Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Nowe kierunki: transmisja wirusa pryszczycy drogą powietrzną do środowiska atmosferycznego, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Tempo depozycji wirusów i bakterii powyżej warstwy granicznej atmosfery. Czasopismo ISME. 12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Długofalowe badanie mikrobiomu związanego z cząstkami stałymi w megamieście. Genome Biology. 21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Przenoszenie drogą powietrzną może mieć
odegrał rolę w rozprzestrzenianiu się ognisk wysoce zjadliwej grypy ptaków w Stanach Zjednoczonych w 2015 r.
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Ocena wpływu zdarzeń pyłowych na zachorowalność na odrę w zachodnich Chinach. Atmospheric Environment. 157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Zoptymalizowana ekstrakcja DNA i sekwencjonowanie metagenomiczne zbiorowisk mikroorganizmów unoszących się w powietrzu. Nat. Protoc. 10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Gromadzenie, określanie wielkości cząstek i wykrywanie wirusów unoszących się w powietrzu. Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, opis produktu, dostępny na stronie: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, opis produktu dostępny na stronie: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK i Mulders, DG (2020).
Wykrywanie nowego koronawirusa 2019 (2019-nCoV) metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym. Eurosurveillance, 25(3), dostępne na stronie: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Oryginał: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Czas publikacji: 18 kwietnia 2020 r.
